pcr图形解析
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PCR问题解析
如何防止PCR形成引物二聚体?
在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,对照marker时都不容易看出其大小,具体是什么原因呢?PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适?
答:1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了,形成引物二聚体的原因很多,如引物设计的不好,在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对;退火温度没有达到最佳,实在不行就做个温度梯度吧;再就是试着改变一下循环数,也许会有帮助。
PCR模板大约在104-106个拷贝。
答2:我觉得是目的条带含量太多了,如果点样太多,负载量太大,就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量,稀释10倍或是减少循环数。
答3:1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法; 2. 可能模板有问题;PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致;
3. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;
4. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的; 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%
DMSO in PCR
1. 如果要增加特异性,要考虑是否升温,复性时候的较高温度有利于筛选特定片段,减少其他GC丰富片段的竞争。
2. 考虑使用甘油:加甘油也可以的,一般终浓度在10%左右.我的实验也曾遇到过GC高达73%的情况,加过甘油非特异性改善了很多,你不妨试一下.
3. 使用甜菜碱:
DMSO can usually give results in GC-rich regions when used at a final
concentration of 5%, although there are reports in the literature of
genes which required 10% DMSO, so a bit of experimentation may be
necessary to optimise the concentration for your genes. Alternatively,
addition of Betaine to concentrations of 1M in reactions can also be
beneficial in GC-rich regions.
There was a comparison pub
PCR步骤
RT-PCR实验步骤
一、总RNA提取
1)试剂配制
1. 0.1TPC水:1000mL双蒸水中加入1mLDEPC,室温下静置4小时。(①用来泡使用
器具处理12小时;②在120℃下高压灭菌30分钟后室温放置备用用来溶解RNA。) 2. 氯仿 3. 异丙醇
4. 75%乙醇:用无水乙醇和高压后的DPEC水配制,现配现用。
2)操作步骤:
1. 样品处理
a. 组织:将组织放在液氮中磨碎(低温处理)。每50-100mg组织加1mL裂解液TRZOL,
用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液TRZOL体积的十分之一。 b. 单层培养细胞;直接在培养板上加入裂解液TRZOL裂解细胞,每10cm2面积加1mL
TRZOL。用取样器抽打几次。(注意:裂解液RZ的加入量根据培养瓶面积决定,不是由细胞数决定。如果加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染。)
c. 细胞悬液:离心取细胞,弃上清。每5-10×106动物细胞和植物细胞加入1mL裂解液RZ。
加裂解液RZ前不要洗涤细胞,以免降解RNA。
d. 血液:直接取新鲜血液,加入3倍体积RZ(推荐0.25mL血液+0.75mLRZ),充分震荡
混匀。
2. 将裂解样品在室温放置5分钟,使得核酸蛋白质复合
有关PCR习题
一、选出一个最符合题意的答案(最佳答案)。 1.以下哪种物质在PCR反应中不需要( )
A.Taq DNA聚合酶 B.dNTPs C.Mg2+ D.RNA酶 E.合适pH缓冲液 2.以下哪种酶可耐高温( )
A.Taq DNA聚合酶 B.Hind Ⅲ C.T4连接酶 D.RNA酶 E.Klenow片段 3.PCR反应正确过程应为( )
A.退火→变性→延伸 B.变性→退火→延伸 C.退火→延伸→变性 D.变性→延伸→退火E.延伸→变性→退火
4. PCR技术的本质是( )
A. 核酸杂交技术 B. 核酸重组技术C. 核酸扩增技术 D. 核酸变性技术 E. 核酸连接技术 5.Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为( )
A.37℃ B.50℃~55℃ C.70℃~75℃ D.80℃~85℃ E.94℃~95℃ 6.能在细胞内进行PCR扩增的PCR仪为( )
A.普通PCR仪 B.梯度PCR仪 C.原位PCR仪 D.荧光PCR仪 E.实时PCR仪 7.在下列哪种PCR仪扩增样品可以了解样品中DNA原始拷贝数( )
A.普通PCR仪 B.梯度PCR仪 C.原位PCR仪 D.荧光实时PCR仪E.定性PCR仪 8.
PCR试题要点
【A型题】 在五个选项中选出一个最符合题意的答案(最佳答案)。 1.以下哪种物质在PCR反应中不需要( )
A.Taq DNA聚合酶 B.dNTPs C.Mg2+ D.RNA酶 E.合适pH缓冲液 2.以下哪种酶可耐高温( )
A.Taq DNA聚合酶 B.Hind Ⅲ C.T4连接酶 D.RNA酶 E.Klenow片段
3.PCR反应正确过程应为( )
A.退火→变性→延伸 B.变性→退火→延伸 C.退火→延伸→变性 D.变性→延伸→退火 E.延伸→变性→退火 4. PCR技术的本质是( )
A. 核酸杂交技术 B. 核酸重组技术
C. 核酸扩增技术 D. 核酸变性技术 E. 核酸连接技术
5.Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为( )
A.37℃ B.50℃~55℃ C.70℃~75℃ D.80℃~85℃ E.94℃~95℃
6.温度均一性较好的PCR仪为( )
A.水浴锅PCR基因扩增仪和压缩机PCR基因扩增仪 B.半导体PCR基因扩增仪和离心式空气加热PCR基因扩增仪 C.压缩机PCR基因扩增仪和半导体PCR基因扩增仪 D.压缩机PCR基因扩增仪和离心式空气加热PCR基因扩增仪 E.水浴锅PCR基因扩增仪和离心式空气加热
图形推理的十大规律解析
图形专项突破中绝大多数例题都是公考真题,命题规范,指导性明确,具有很高的价值。图形专项突破编写系统,几乎含盖图形推理全部类型的题目。 图形推理的两大灵魂是数量关系和图形的转动。牢牢把握住这两大灵魂就基本把握了图形推理题目。在这两大灵魂统帅下的十大基本规律,是每个想要在公考中取得优异成绩的考生必须系统熟练把握的。
图形推理的两大灵魂:数量关系和图形的转动。这里以2007年国家公务员考试真题为例子来说明图形推理的两大灵魂。 1.
答案:B
分析:方法一,从图形旋转的角度来分析这个题目。顺时针方向看,会发现黑色小方框在作顺时针
旋转。
具体的说,第一行三个图形中,黑色小方框在作顺时针旋转;然后从第三列往下看,发现黑色小方框仍然在作顺时针旋转。整个观察顺序是:第一行,从左向右,到了第三个图形,从上往下;到了右下角的图形,从右往左,到了左下角,再从下往上。
如果选择逆时针方向分析,会发现黑色小方框在作逆时针旋转。最后同样得到答案B。 方法二,从图形的数量关系来分析这个题目。图中含有黑色小方框的图形是成对出现的。因此答案为B。
答案:A
1,3,5。
第二列,从上往下,三个图形中,图形外的线段数量分别是7,
PCR引物设计要点
PCR引物设计要点
1. 书写规则
设计引物时,5’端引物与目的序列正义链相同,而3’端引物则与目的序列正义链互补,书写时从引物的5’端至3’端(即5’端引物不变,3’端引物与目的序列互补并相反); 2. 引物长度
一般引物长度为18~30碱基(不包括5’端添加的修饰),引物太长和太短都不好; 3. GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%,不要有聚嘧啶或聚嘌呤,尤其3’端不应超过3个连续的G或C。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴,上下游引物的GC含量不能相差太大; 4. 退火温度
可以用软件PrimePrimer来计算退火温度,在引物短于20bp时,可以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5估计Tm值(解链温度),有效引物的Tm为55~65℃之间较好,如果待扩增基因的GC含量较高(超过50%),引物的退火温度可设计得高一点,例如接近65℃,因为提高退火温度可以降低非特异性扩增。一对引物的退火温度应尽量接近,相差范围应在5℃之内;
一般初次PCR使用的退火温度比计算出的解链温度低5℃,如果扩不出,可试着将退火温度降低5℃ 和升高5℃再试一下,但一般不要1℃ 1℃升,或1℃ 1℃
临床PCR实验攻略
临床PCR实验攻略
? 基础篇
一、如何选择试剂,评价试剂是否符合自己实验室条件?
现在临床PCR实验室使用的试剂大部分都是各生产企业提供的商品化的试剂盒,那么试剂质量的好坏直接决定了实验结果的好坏,而不同厂家试剂的性能、质量和价格千差万别,如何选择一款合适的试剂对每个PCR实验室都至关重要,一般来说,选择试剂主要从以下几个方面进行评价: 1、重复性
首先,试剂检测结果的重复性直接展现了试剂的方法学及其质量的好坏,是评价试剂好坏最明显、最直接的指标。
其次,我们在此说的试剂重复性是指对原始样本检测的重复性,而不是对某一个样本提取的核酸进行重复性的检测和评价。
最后,试剂的重复性对于疗效检测、用药指导有着重大的意义,一个重复性好的试剂,往往能够在病人的抗病毒治疗过程中,给医生和病人提供最直接、最可靠的数据,让医生和病人对疾病进展有更清楚的认识,从而制定合理的治疗方案,实现更好的治疗效果。 2、灵敏度
一个试剂的灵敏度往往能够体现该试剂的技术水平和先进程度,同时对于临床病症的监测有着举足轻重的意义。以乙肝为例来说,我国的乙肝复发率远远大于发达国家,同时由乙肝病毒感染转换为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列,这很大程度上与对低载量病毒监控的严
PCR自测题
PCR自测题
一、名词解释 1.PCR 2.变性 3.退火 4.延伸 5.逆转录PCR 6.停滞效应 7.共享引物PCR 8.多重PCR 9.反向PCR 10.原位PCR 11.LCR
二、单项选择题
1.PCR反应中,所设计引物的长度一般为( )
A.5~10核苷酸 B. 15~30核苷酸 C. <50个核苷酸 D.长度任意 E. 以上答案均不对
2.引物设计时G+C含量在引物中一般占( c )
A. 20~40﹪ B. 30~60﹪ C. 45~55﹪ D.越高越好 E.含量随意 3.以下说法错误的是( e )
A 引物中的碱基组成应该尽可能的随机分布。 B 引物自身不应该存在互补序列
C 设计引物时应考虑使3?端引物和5?端引物具有相似的Tm值 D 引物的5?和3?端必须和模板严格配对结合
E 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70﹪ 4.下列说法正确的是( )
C. PCR反应常用的缓冲液为10-50mmol/L的Tris-HCl(室温 PH 8.3-8.8) D. 10mmol/L的KCl能促进引物的退火 E. 加入
PCR技术及其应用
第八章 PCR技术及其应用
PCR技术的建立① Khorana(1971)等提出在体外经 DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—―修复复制”但由于测序和引物合成的困难,以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能,所以,Khorana的 设想被人们遗忘了……
②
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现
Mullis的构思引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
③
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术
Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)100
酶 80 活 性 6040
(%)
20 40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
Kary B. Mullis <