考马斯亮蓝法测蛋白质含量

蛋白测定经典法

蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法

[实验目的]

学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量的方法

[实验原理]

考马斯亮蓝G 250染料

碱性

氨基酸 磷酸 max变为595nm（蓝色）

芳香族

[器材与试剂]

器材

722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂

1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.00mg/ml。

2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。

[实验方法]

标准方法

1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。

3.用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g鲜重) =

查得的蛋白质（ g/g） 提取液总体积（m

分光光度法介绍

分光光度法是利用溶液中特定溶质的光吸收测定其浓度的方法，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。 一 Lambert定律

当一束平行单色光垂直照射于一均匀物质溶液时，溶液将吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则在溶液中的光程越长，光线强度的减弱也越显著。 设：入射光强度为I0，透射光强度为I，L代表光在溶液中的光程。 I0

lg =K1L I

K1是常数，受光线波长，溶液性质，溶液浓度影响。 二 Beer定律

当一束光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若光程不变，则溶液的浓度越大，光吸收越强，透射光强度的减弱也越显著，光线减弱的比例与溶液浓度呈正比。 I0

lg =K2C I

K2为吸收系数，是常数。溶液对光吸收的强弱与溶液浓度C成正比。 三 Lambert-Beer定律 将以上两个定律合并： Io

lg =KCL I

IoI

令A=lg T= 则A=KCL=-lgT

IIoT为透光度，A为吸光度，K为消光系数

四 待测样品浓度的计算 A标=KC标L A样=KC样L 由于是同一物质及相同的光程，则：

A样/A标=KC样L/KC标L=C样/C标 即：C样=（A样/A标）*

实验六 考马斯亮蓝染色法测定牛奶中蛋白质含量

一、目的要求

学习考马斯亮蓝染色法测定牛奶中蛋白质含量的方法和原理，标准曲线的绘制和回归方程的使用，分光光度计的使用。 二、基本原理

考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力。通过疏水作用与蛋白质相结合，形成的蓝色蛋白质染料复合物，在595 am处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料复合物在595 nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的测定。 分光光度法的原理：通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。 三、器材和试剂 1．器材

可见分光光度计，玻璃比色皿，试管 2．试剂

考马斯亮蓝G一250溶液：精确称取考马斯亮蓝G一250 100 mg，溶于50 mL 95％的乙醇，再加入100 mL 85％的磷酸，稀释定容至1 000 mL备用。

标准蛋白质溶液：精确称取牛血清白蛋白10 mg，加水溶解并定容至10 ml，冰冻，用时吸取上述溶液1 ml，用蒸馏水稀释至10 ml，即为100 μg/ml的标准蛋白质溶液。

样品的制作：准确吸取2 ml牛奶(市场上现买)加水至1000 ml制作样品。

四、操

实验八 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

一 实验目的

学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

二 实验原理

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。

三 实验器材

（1）旋涡混合器。

（2）试管1.5cm×15cm（×8）

（3）吸管0.10ml（×1），0.50ml（×2），1.0ml（×2），2.0ml（×1），2.0ml（×1）。 （4）722型（或7220型）分光光度计。 （5）容量瓶1000ml（×1）。 （6）量筒100ml（×1）。 （7）电子分析天平。

四 实验试剂

1、9％NaCL溶液。

2、标准蛋白液；牛血清白蛋白（0.1mg/ml），准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml。

3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马

考马斯亮蓝

科技名词定义

中文名称：

考马斯亮蓝

英文名称：

Coomassie brilliant blue;coomassie [brilliant] blue

定义1：

属于三苯甲烷类染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；考马斯亮蓝G250是布拉德福德(Bradford)蛋白质定量试剂的主要成分。

所属学科：

生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）

定义2：

广泛用于对电泳蛋白质染色的蓝色染料。也可显示出细胞骨架及蛋白质在细胞中的显微分布。

所属学科：

细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）

本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录

化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 处理方法 化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 处理方法 展开 编辑本段化学性质 分子结构如右图 Coomassie brilliant blue G-250

考马斯亮蓝有G250和R250两种。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-

考马斯亮蓝

科技名词定义

中文名称：

考马斯亮蓝

英文名称：

Coomassie brilliant blue;coomassie [brilliant] blue

定义1：

属于三苯甲烷类染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；考马斯亮蓝G250是布拉德福德(Bradford)蛋白质定量试剂的主要成分。

所属学科：

生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）

定义2：

广泛用于对电泳蛋白质染色的蓝色染料。也可显示出细胞骨架及蛋白质在细胞中的显微分布。

所属学科：

细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）

本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录

化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 处理方法 化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 处理方法 展开 编辑本段化学性质 分子结构如右图 Coomassie brilliant blue G-250

考马斯亮蓝有G250和R250两种。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-

一、实验目的

1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。

3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。

二、实验原理

1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

紫外光：10-400 nm

可见光：400-780 nm（可被人们的眼睛所感觉） 特点：带光谱、分子光谱 应用：定性分析-最大吸收波长；

定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法） a.定性分析原理：

吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状. b.定量分析原理：

根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。

定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。

c.仪器组成部件:

各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。

2.本实验采用紫外分

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、目的与要求

1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。

二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。

三、仪器与试剂

硫酸铜（CuSO4·5H20）硫酸钾硫酸（密度为1.8419g/L）硼酸溶液（20g/L）

氢氧化钠溶液（400g/L）0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。

混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。

微量定氮蒸馏装置：如图3- 所示。Array图3- 微量凯氏定氮装置

1、电炉；

2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；

3、螺旋夹a；

4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；

5、反应室；

6、反应室外层；

7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。

四、实验步骤

1、样品消化

称取样品约2.00g（±0.001g），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，