有关pcr技术
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有关PCR习题
一、选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1．以下哪种物质在PCR反应中不需要（ ）
A．Taq DNA聚合酶 B．dNTPs C．Mg2+ D．RNA酶 E．合适pH缓冲液 2．以下哪种酶可耐高温（ ）
A．Taq DNA聚合酶 B．Hind Ⅲ C．T4连接酶 D．RNA酶 E．Klenow片段 3．PCR反应正确过程应为（ ）
A．退火→变性→延伸 B．变性→退火→延伸 C．退火→延伸→变性 D．变性→延伸→退火E．延伸→变性→退火
4． PCR技术的本质是（ ）
A． 核酸杂交技术 B． 核酸重组技术C． 核酸扩增技术 D． 核酸变性技术 E． 核酸连接技术 5．Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为（ ）
A．37℃ B．50℃～55℃ C．70℃～75℃ D．80℃～85℃ E．94℃～95℃ 6．能在细胞内进行PCR扩增的PCR仪为（ ）
A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光PCR仪 E．实时PCR仪 7．在下列哪种PCR仪扩增样品可以了解样品中DNA原始拷贝数（ ）
A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光实时PCR仪E．定性PCR仪 8．
PCR技术及其应用
第八章 PCR技术及其应用
PCR技术的建立① Khorana(1971)等提出在体外经 DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—―修复复制”但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
②
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现
Mullis的构思引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
③
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术
Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)100
酶 80 活 性 6040
(%)
20 40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
Kary B. Mullis <
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA
实时荧光定量PCR技术
天为时代核酸系列讲座之院
华中科技大学同济医学
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20
讲 座 提 纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
实时荧光定量PCR 原理常 规 PCR技术：
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量？
定量原理
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图：横坐标：扩增循环数(Cycle);纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
实时荧光定量
实时荧光定量PCR技术
天为时代核酸系列讲座之院
华中科技大学同济医学
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20
讲 座 提 纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
实时荧光定量PCR 原理常 规 PCR技术：
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量？
定量原理
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图：横坐标：扩增循环数(Cycle);纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
实时荧光定量
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA
PCR技术及注意事项
PCR技术应用及注意事项威斯腾生物技术中心 TEL:400 675 6758 2014.9.1
背景
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是一种用于放大扩增特定的 DNA片段的分子生物学技术。
1971 Khorana 等最早提出核酸体外扩增的设想； 1983年Mullis发明并申请专利。
原理
根据DNA的半保留复制。相关酶
双链DNA
单链
DNA聚合酶 碱基互补配对
复制
两分子拷贝。
在体外实验中，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复 性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物， DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
反应体系
缓冲液 4种dNTP混合物(终浓度) 引物(终浓度) 模板DNA Taq DNA聚合酶(耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个 循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。)
Mg2+(终浓度) 双蒸水
步骤
变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR
核酸分子杂交及PCR技术
核酸的分子杂交技术
一、核酸分子杂交
用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类
液相杂交
核算分子杂交 印记杂交
固相杂交
原位杂交
1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。 2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭
缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理 1、变性：
在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 ﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变
PCR技术培训教材
PCR 培训教材
PCR基础理论
一、半保留复制及转录、逆转录
(1)DNA的半保留复制(semiconservative replication)
DNA是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过DNA复制(replication)由亲代传给子代。在DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每一条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(图1)。
(2)RNA的转录（transcription）过程
以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息由DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP）。转录产生初级转录物为RNA前体（RNA