线粒体DNA提取方法

DNA提取

191

论　著 　

线粒体DNA提取方法的比较3

李伟文　陆松敏　刘建仓　武　凡　李　萍　柏干荣

第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042)

　　摘要　目的将提取线粒体DNA的碱变性法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线Triton法、粒体DNA的方法。方法分离Wistar大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA量最多,Triton法最少。OD260 ～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于OD280均在1.78结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列。产量多的优点,该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序。

关键词　线粒体;DNA;分子遗传学

　　1981年,Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA(mtDNA),进行了全序列分析。此后,mtDNA的研究日益得到重视。本实验将Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1　材料和方法111112　细

DNA提取

191

论　著 　

线粒体DNA提取方法的比较3

李伟文　陆松敏　刘建仓　武　凡　李　萍　柏干荣

第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042)

　　摘要　目的将提取线粒体DNA的碱变性法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线Triton法、粒体DNA的方法。方法分离Wistar大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA量最多,Triton法最少。OD260 ～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于OD280均在1.78结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列。产量多的优点,该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序。

关键词　线粒体;DNA;分子遗传学

　　1981年,Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA(mtDNA),进行了全序列分析。此后,mtDNA的研究日益得到重视。本实验将Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1　材料和方法111112　细

DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书 作者: Allanflying (站内联系TA) 发布: 2012-09-11

一．利用DNeasy? Blood & Tissue试剂盒提取样本总DNA 1．前处理： 注意：

1） 石蜡包埋组织的DNA一般小于650bp，还要视样本类型与保存年限而定。 2） 固定剂一般为福尔马林或酒精。不推荐用蛾酸固定的样本。 3） 溶解时间随样本类型和溶解状态而定。 4） 产量视样本类型和保存年限而定。推荐用50-100ul的AE缓冲液洗脱纯化的DNA。 5） 开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃，用于操作步骤9）。 1.石蜡包埋组织的前处理 操作步骤：

1） 将小片石蜡包埋的组织（小于25mg）放入2ml离心管中（自备）。 2） 加入1200ul的二甲苯，用力涡旋震荡。 3） 最大转速室温（15-25°）离心5分钟。 4） 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。

5） 往沉淀中加1200ul的

各种DNA提取方法提取方法提取方法提取方法

一，基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管

植物DNA的提取分离技术

摘要：主要介绍了近年来国内外几种常用的DNA提取方法：CTAB法、SDS法等，并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时，并介绍了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词：植物DNA 提取方法 研究进展

市售中药材大多为干品,而中药材的加工和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利于DN的完整性, 为达到要求目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多[1-12]，其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法[13]。由于不同植物的材料组分和干湿程度各异，因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。他们在探索新方法的同时，也针对不同的植物，在传统的提取方法上进行着一些新的改良。

1.十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法

在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的一种。它既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀，因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。 1.1方法及原理

CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中

线粒体的提取步骤

制备程序：

a. 组织匀浆：称取50-200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS冲洗，用剪刀剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution。上下研磨组织20次。

b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。计7

数。每次提取需要2-5 × 10个细胞。加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内。用间隙严密的研杵研磨细胞30-40次。

1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。800 × g 离心5 min 4 oC。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底,弃去。

2. 收集上清液并转移到新的离心管。800 × g 离心5 min at 4 oC。弃沉淀

3. 将上清液转移到新的离心管。10,000 × g 离心10 min 4 oC。离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，可收集用于对照实验。线粒体沉淀在管底。

4. 洗涤线粒体：清除管内壁粘连的液体和碎片，加入0.2 ml Mito Sdution轻弹管底重悬线粒体沉淀，12,000 × g 离心10

线粒体DNA的损伤及其对细胞的影响

张明帅 生物化学 291305117

摘要： 线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)是线粒体内具有遗传效应的双股闭环DNA分子，其遗传信息量虽小，却控制着线粒体一切最基本的性质，对细胞及其功能有着重要影响。mtDNA的损伤会导致细胞结构及功能的变化，已越来越引起人们的重视。本文就近年来mtDNA的损伤及其对细胞影响的研究进展作一综述。

关键词：DNA 线粒体 DNA损伤 细胞

线粒体是细胞质中最重要的细胞器之一，作为细胞能量储存和提供的场所，其以氧化磷酸化方式将食物内蕴藏的能量转变为可被机体直接利用的ATP高能磷酸化合物。动物体85%的能量产生于此。线粒体内的线粒体DNA( mitochondrial DNA, mtDNA)是核外惟一具有遗传效应的物质，控制着线粒体一此基本性质，对细胞的结构及功能有着重要影响。mtDNA由于其自身的结构特点及其处于线粒体这个氧化磷酸化活跃的部位，极易受损，从而影响细胞的能量代谢、分裂增生等，并且与细胞的凋亡、恶变等有着密切的关系。

1线粒体DNA的结构特点及其易损性

mtDNA具有自我复制功能并能控制一定的遗传性状，其遗传信息量虽小，却控制着线粒体一此最基

线粒体DNA的损伤及其对细胞的影响

张明帅 生物化学 291305117

摘要： 线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)是线粒体内具有遗传效应的双股闭环DNA分子，其遗传信息量虽小，却控制着线粒体一切最基本的性质，对细胞及其功能有着重要影响。mtDNA的损伤会导致细胞结构及功能的变化，已越来越引起人们的重视。本文就近年来mtDNA的损伤及其对细胞影响的研究进展作一综述。

关键词：DNA 线粒体 DNA损伤 细胞

线粒体是细胞质中最重要的细胞器之一，作为细胞能量储存和提供的场所，其以氧化磷酸化方式将食物内蕴藏的能量转变为可被机体直接利用的ATP高能磷酸化合物。动物体85%的能量产生于此。线粒体内的线粒体DNA( mitochondrial DNA, mtDNA)是核外惟一具有遗传效应的物质，控制着线粒体一此基本性质，对细胞的结构及功能有着重要影响。mtDNA由于其自身的结构特点及其处于线粒体这个氧化磷酸化活跃的部位，极易受损，从而影响细胞的能量代谢、分裂增生等，并且与细胞的凋亡、恶变等有着密切的关系。

1线粒体DNA的结构特点及其易损性

mtDNA具有自我复制功能并能控制一定的遗传性状，其遗传信息量虽小，却控制着线粒体一此最基

线粒体DNA的损伤及其对细胞的影响

张明帅 生物化学 291305117

摘要： 线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)是线粒体内具有遗传效应的双股闭环DNA分子，其遗传信息量虽小，却控制着线粒体一切最基本的性质，对细胞及其功能有着重要影响。mtDNA的损伤会导致细胞结构及功能的变化，已越来越引起人们的重视。本文就近年来mtDNA的损伤及其对细胞影响的研究进展作一综述。

关键词：DNA 线粒体 DNA损伤 细胞

线粒体是细胞质中最重要的细胞器之一，作为细胞能量储存和提供的场所，其以氧化磷酸化方式将食物内蕴藏的能量转变为可被机体直接利用的ATP高能磷酸化合物。动物体85%的能量产生于此。线粒体内的线粒体DNA( mitochondrial DNA, mtDNA)是核外惟一具有遗传效应的物质，控制着线粒体一此基本性质，对细胞的结构及功能有着重要影响。mtDNA由于其自身的结构特点及其处于线粒体这个氧化磷酸化活跃的部位，极易受损，从而影响细胞的能量代谢、分裂增生等，并且与细胞的凋亡、恶变等有着密切的关系。

1线粒体DNA的结构特点及其易损性

mtDNA具有自我复制功能并能控制一定的遗传性状，其遗传信息量虽小，却控制着线粒体一此最基

主要试剂的配制

参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：

（1）0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。

（2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。

（3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。 （4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。 （5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。

（6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4