动物生物化学实验

实验一 血清蛋白质含量测定

牛血清蛋白：BSA。

血浆：指血液的液体成分，淡黄色（因含胆红素）。含白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原。血液经抗凝处理、离心沉淀后，获得的液体部分。

血清：血液凝固后，释出的液体。不含纤维蛋白原及游离钙离子。

蛋白质定量分析是动物生物化学和其他生命科学研究中经常用到的实验项目。蛋白质是生物体内最为重要的生物大分子之一，其种类繁多、结构多样、功能各异，而且分子量相差很大，所以很难建立一个理想而通用的蛋白质定量分析方法。目前测定蛋白质含量的方法很多，常用的测定方法有Folin—酚法（Lowry法）、紫外吸收法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染料结合法等，每种方法在实践中都有其优点和局限性。本实验采用考马斯亮蓝染料结合法（Bradford法）。(灵敏度最高)

一、实验目的

1．掌握分光光度法测定的原理，分光光度计的结构和基本操作要点

（光源-单色器-样品室-检测器-显示器）

2．掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的原理和操作方法 3．掌握微量移液器的使用方法

4．了解蛋白质含量测定中标准曲线的制作方法

二、实验原理

染料考马斯亮蓝G-250（R250，结合后可以解离）在游离状态下呈红色，最大吸收峰为465 nm。它能与蛋白质的疏水

实验一 血清蛋白质含量测定

牛血清蛋白：BSA。

血浆：指血液的液体成分，淡黄色（因含胆红素）。含白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原。血液经抗凝处理、离心沉淀后，获得的液体部分。

血清：血液凝固后，释出的液体。不含纤维蛋白原及游离钙离子。

蛋白质定量分析是动物生物化学和其他生命科学研究中经常用到的实验项目。蛋白质是生物体内最为重要的生物大分子之一，其种类繁多、结构多样、功能各异，而且分子量相差很大，所以很难建立一个理想而通用的蛋白质定量分析方法。目前测定蛋白质含量的方法很多，常用的测定方法有Folin—酚法（Lowry法）、紫外吸收法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染料结合法等，每种方法在实践中都有其优点和局限性。本实验采用考马斯亮蓝染料结合法（Bradford法）。(灵敏度最高)

一、实验目的

1．掌握分光光度法测定的原理，分光光度计的结构和基本操作要点

（光源-单色器-样品室-检测器-显示器）

2．掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的原理和操作方法 3．掌握微量移液器的使用方法

4．了解蛋白质含量测定中标准曲线的制作方法

二、实验原理

染料考马斯亮蓝G-250（R250，结合后可以解离）在游离状态下呈红色，最大吸收峰为465 nm。它能与蛋白质的疏水

生物化学实验指导 实验一 蛋白质性质实验

【实验目的】

加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。 【实验原理】

1.蛋白质的沉淀反应

蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型：

（1）可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，基本

上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀

反应

为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作

用以及等电点沉淀等。

用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。

（2）不可逆的沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结

生物化学实验指导 实验一 蛋白质性质实验

【实验目的】

加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。 【实验原理】

1.蛋白质的沉淀反应

蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型：

（1）可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，基本

上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀

反应

为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作

用以及等电点沉淀等。

用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。

（2）不可逆的沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结

1.

天然脂肪酸在结构上有那些特点。天然脂肪酸通常具有偶数碳原子，链长一般为12-22碳。脂肪酸可分为饱和、单不饱和与多不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸的双键位置，有一个双键几乎总是处于C9-C10之间(△9)，并且一般是顺式的。指出下列膜脂的亲水部分和疏水部分磷脂酰乙醇胺 胆固醇

半乳

糖基脑苷脂 卵磷脂

2. 什么叫蛋白质的变性？哪些因素能导致蛋白质的变性？ 3. 哪些因素影响蛋白质的溶解度？如何影响？

4.

有一蛋白质分子在pH=7的水溶液中折叠成球状。请回答下列问题：（1）在Val、Pro、His、Asp、Phe、Ile和Lys中，哪些位于分子内部？哪些位于什么叫蛋白质的构象？维持蛋白质构象的作用力有哪些？

5. 蛋白质如何进行分类？

6. 分别说明pH、温度、酶浓度对酶促反应速度的影响。 7. 什么是酶的活性部位？别构部位？ 8. 简述锁钥学说、诱导契合学说的要点。 9.

过氧化氢酶的Km值为2.5 10 2

mol/L，当H2O2的浓度

为100mmol/L时，过氧化氢酶被底物所饱和的百分数是多

少？

10. 什么是酶的专一性？有那些类型？ 11. 与其它催化剂相比，酶有那些催化特征？ 12.

什么叫酶活力？如何测定酶活力？

呼吸链中存在如下反应：

（1）NADH

生物化学实验讲义

实验一 蛋白质的颜色反应与沉淀反应

蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应。不同蛋白质所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦可不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物质是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白物质的定量测定的依据。

多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。

实验材料与仪器

鸡（或鸭）蛋白

吸管0.5 ml（×1）、1ml（×3）、2 ml（×2）、5ml（×2） 滴管

试管1.5×15cm（×10） 水浴锅 电炉

吸滤瓶500ml（1） 布氏漏斗

试剂

1. 卵清蛋白液：将鸡（或鸭）蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2. 1%苯酚溶液：苯酚1ml，加蒸馏水稀释至100ml。

3. 1%白明胶液：1g白明胶溶于少量热水，完全溶解后稀释至100ml。

4. 米伦（Millon）试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（比重1.42），水浴加温助溶，溶解后加二倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用。此试剂可长期保存。

5. 0.5%茚三酮溶液：0.5g茚三

第五章 生物氧化

一、名词解释

1.氧化磷酸化 2.呼吸链 3.化学渗透学说 4.偶联部位 二、单项选择题

（在备选答案中只有一个是正确的）

1．下述有关氧化磷酸化的描述哪一项是错误的（ ）

A.在线粒体内膜上进行

B.是指呼吸链上的电子传递与ADP磷酸化遇联进行的过程 C.氧化磷酸化的效率可用P/O比值表示

D.在无氧的情况下，糖酵解过程生成的NADH靠穿梭进入线粒体呼吸链彻底氧化 2．下列不是高能磷酸化合物的是（ ）

A.ATP B.6-P-G C.磷酸烯醇式丙酮酸 D.氨其甲酰磷酸 3．下列物质对氧化磷酸化无明显影响的是（ ）

A.寡霉素 B.甘氨酸 C.2，4-二硝基苯酚 D.氰化物 4．下列关于FAD等的描述那一条是错误的（ ）

A.FAD只传递电子，不传递氢 B.FAD是一种辅基

C.FAD传递氢机制与FMN相同

D.FAD分子中含一分子核黄素，一分子腺嘌呤，二分子核糖，二分子磷酸 5．琥珀酸氧化呼吸链成分中没有（ ）

A.FMN B.铁硫蛋白 C.FAD

生物化学实验指导 实验一 生化实验基本操作

一. 玻璃仪器的洗涤

在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻壁上。 ㈠ 常用的洗涤方法：

1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。

2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。（1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上；（2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。

3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法：（1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；（2）也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗；（3）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液4~6小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次。

4.新购置的玻璃仪器，应先置于1~2%稀盐酸溶液中浸泡2~6小时，除去附着的游离碱，

生物化学实验指导.txt老子忽悠孩子叫教育，孩子忽悠老子叫欺骗，互相忽悠叫代沟。▲ 男人 这花花世界，我要用什么颜色来吸引你。 生物化学实验指导

（供五年制临床医学、口腔医学、预防医学、护理学、 社会体育等本科专业使用）

主编：生化教研室

遵 义 医 学 院

二00六年四月

生物化学实验须知

（Genera1 ingtructions）

一、实验目的

1．培养学生严谨的科学作风，独立工作能力及科学的思维方法。

2．学习基础的生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。 二、实验的总要求

1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。

2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。为达到此目的，实验者应注意：①一切步骤都按正规操作法进行；②样品

实验四 双缩脲法测定蛋白质浓度

[实验原理]

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫色配合物，在540nm处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质和浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。

[实验仪器及用品]

实验器材：容量瓶、试管、吸管、722型（或7220型）分光光度计。 实验试剂：双缩脲试剂；卵清蛋白质溶液；未知液 [实验内容及步骤] 一、标准曲线的绘制

将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。 瓶号 1 2 3 4 5 6 2mg/ml卵清蛋白液体积 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 蒸馏水 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 稀释至刻度 蛋白质浓度/（mg/ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 取干净试管7只，按0、1、2、3、4、5、6编号，1-6号管分别加入上述不同浓度的蛋白质液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加入双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫色出现，用540nm光测定各管吸光度，绘制浓度-吸光度曲线。

二、样液的测定

取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml臵