载体去磷酸化原因

质粒载体单酶切后的去磷酸化

1、 去磷酸化体系的确定：

一般有两种体系：20ul体系和50ul体系

ddH2O X to 20ul SAP buffer 2ul

SAP 1ul（一般0.05-2μg的DNA用1ul的SAP足够） 质粒载体 m ul [m=（0.02nmol*质粒大小kb*660）/质粒浓度] 2、 反应条件：

37℃反应30-60min

65反应15-30min（灭活SAP）

用1X TE将去磷酸化后的载体补足300ul（为了下一步纯化载体时减少损失）

载体纯化（个人不建议用胶回收柱纯化，因为纯化的效率很低，除非你的载体浓度很高或者你的柱子效率很高。建议使用酚氯仿纯化DNA的方法纯化载体） 加入 酚：氯仿：异丙醇（25: 24:1） 300ul 充分混匀10min左右

8000rmp离心5min，分层后小心吸取上清于新离心管（千万不要吸到中间层，宁肯少吸点上清）

加入300ul异丙醇于上清中，充分混匀

80

蛋白质磷酸化与信号传导

蛋白質磷酸化與信號傳導

對所有真核生物而言，蛋白質的磷酸化是細胞內信號傳遞的關鍵步驟，舉凡在細胞代謝、生長、增殖、癌變調控方面，蛋白質的磷酸化都扮演著重要角色。目前在真核細胞內已發現有400多種蛋白激酶和1000多種磷酸蛋白。通過蛋白質磷酸化，機體得以改變細胞內蛋白質活性，或藉以改變酵素活性、或藉以傳遞信號、或調節細胞內各個生理過程。隨著愈來愈多的信號傳導路徑被證實與蛋白質磷酸化相關，此一主題己是當今細胞生物學研究的熱點。

蛋白質的可逆磷酸化

蛋白質的磷酸化和去磷酸化是一個可以相互轉化的過程，分別由機體藉由調控細胞內各類蛋白激酶（protein kinases）和蛋白磷酸酶（phosphatases）的活性來啟動或抑制。通過磷酸化和去磷酸化兩種構象的互變，導致蛋白質活性改變而表達其特殊的生理功能。現已證實，細胞的許多功能蛋白，如激酶、酶蛋白、受體、視蛋白、運輸蛋白、收縮蛋白、調節蛋白、核蛋白、離子通道、離子幫浦等，均能發生蛋白質的磷酸化與去磷酸化。蛋白質磷酸化的方式有兩種：一種是蛋白質自身磷酸化，如胰島素受體、C激酶、G激酶、Ca2+·CaM激酶、EGF受體、PDGF受體、IGF-1受體、FGF受體、CSF-1受體、

NovelZincPhosphateTopologiesDefinedbyOrganicLigands

JianFanandBrianE.Hanson*

DepartmentofChemistry,VirginiaPolytechnicInstituteandStateUniVersity,Blacksburg,Virginia24061

ReceivedMarch1,2005

Sixnewzincphosphates[C18H20N4][Zn4(HPO4)4(H2PO4)2(C18H18N4)3] 2H2O(1),[Zn4(HPO4)4(C18H18N4)3] 4H2O(2),[Zn3(HPO4)3(H2PO4)(C22H22N8)0.5(C22H24N8)0.5](3),[Zn2(HPO4)2(C18H16N4)](4),[Zn(HPO4)(C18H14N2)](5),and[Zn2-(HPO4)2(C12H10N4)](6)havebeensynthesizedundermildhydrothermalconditionsinthepresenceof1,4-bis(N-benzimidazolyl)butane(L1),1,2,4,5-tet

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因cDNA克隆及其在甲醇毕赤酵母中的表达

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2005,13(3):282~287

··研究论文

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基

基因(的克隆及其在毕赤酵母中的表达*

宋波涛柳俊**谢从华成善汉

(华中农业大学园艺林学学院，国家蔬菜改良中心华中分中心，园艺植物生物学教育部重点实验室，

湖北省马铃薯工程技术研究中心，武汉430070)

摘要：用RT-PCR结合RACE的方法，在腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因(温处理的马铃薯(

目标片段为体。DNA序列测定结果表明，

从低的保守位点设计1对引物，

L.)块茎cDNA中，扩增出1条约1.9kb的特异性条带，并将其克隆到pBluescriptSK域载

编码521个氨基酸。全长为1854bp，包含一个1563bp的开放阅读框架，5'端

有63bp的非翻译区，3'端包含219bp的非编码序列，3'端poly(A)尾端上游12和19bp处有加尾信号AATAAA。该基因已在GenBank注册，登记号为AY186620。将该基因PCR突变后，克隆到酵母表达载体pMET琢-B中，构成表达

BioTek应用手册

A p p l i c a t i o n N o t e

药物筛选

一种常见的GPCR传感器-ERK1/2的自动均相磷酸化检测 -均相LanthaScreen®细胞分析

Paul Held and Peter Banks, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT

Kristin Huwiler, Matthew Robers, and Bonnie Hanson, Life Technologies, Madison, WI

关键词：GPCR, LanthaScreen, ERK，TR-FRET

GPCRs的激活会刺激活化各种信号通路，大部分信号通路的激活均可能导致细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化。因此，针对ERK1/2的磷酸化检测可以代替GPCRs的活性检测。本文介绍了一种将BacMam调节的GFP-ERK2 传感器基因传递技术和LanthaScreen®细胞学实验技术相结合的时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-FRET），该技术用来检测ERK2细胞外的磷

中国药物与临床2012年1月第12卷第1期Chinese Remedies &Clinics ，January 2012,Vol.12,No.1肺间质纤维化是一种渐进性加重的致命性弥漫

性肺疾病。肺内成纤维细胞和损伤的气道上皮细胞

向肌成纤维细胞转分化是特发性肺纤维化发生的重

要病理因素［１］，α鄄平滑肌肌动蛋白（α鄄ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ

ａｃｔｉｎ，α鄄ＳＭＡ）是研究肌成纤维细胞分化的标记物。

近年来，肺纤维化转分化病理过程中涉及到的信号

通路一直是研究的热点。ｃ鄄ｊｕｎ氨基末端激酶（ｃ鄄ｊｕｎ

ＮＨ２鄄ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ，ＪＮＫ）

信号通路参与调控许多细胞增殖、分化与凋亡，是丝裂原活化蛋白激酶家族的

重要一员［２］。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等［３］发现ＪＮＫ信号通路在人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中发挥作用，而关于体内ＪＮＫ信号通路在肺纤维化转分化过程中是否发挥作用尚未见相关研究报道。ＳＰ６００１２５作为ＪＮＫ激酶抑制剂，可特异性阻断ＪＮＫ细胞信号通路［４］。本实验使用ＳＰ６００１２５进行干预，通过观察大鼠肺组织中ｐ鄄ＪＮＫ和α鄄ＳＭＡ的表达水平，从分子信号角度探讨肺纤维化转分化的发病机制。1材料与方法１．１主要试剂及药品：盐酸博莱霉素（ＢＬＭ，

水解酸化运行讨论

栏杆 发表于: 2009-4-22 13:31 来源: 水网博客——水业思想的集散地！

现在城镇污水处理厂在水解酸化应用上越来越多，但是真正实现水解酸化，提高bc比目的的不多，好多人都在迷茫彷徨阶段，前段水解酸化后继处理工艺应该采用何种方式适合，而不是一味跟风的取消初沉，然

后后续再用其他工艺，一种茫然跟风现象。

最新回复

栏杆 at 2009-4-22 13:43:10

一、厌氧生化处理的概述

废水厌氧生物处理是指在无分子氧的条件下通过厌氧微生物（包括兼氧微生物）的作用，将废

水中各种复杂有机物分解转化成甲烷和二氧化碳等物质的过程。

厌氧生化处理过程：高分子有机物的厌氧降解过程可以被分为四个阶段：水解阶段、发酵(或酸

化)阶段、产乙酸阶段和产甲烷阶段。

1、水解阶段

水解可定义为复杂的非溶解性的聚合物被转化为简单的溶解性单体或二聚体的过程。

2、发酵（或酸化）阶段

发酵可定义为有机物化合物既作为电子受体也是电子供体的生物降解过程，在此过程中溶

解性有机物被转化为以挥发性脂肪酸为主的末端产物，因此这一过程也称为酸化。

3、产乙酸阶段

在产氢产乙酸菌的作用下，上一阶段的产物被进一步转化为乙酸、氢气、碳酸以

24

第五章 核酸化学

一、选择题

(一)A型题

1. 在DNA水解液中含量与dAMP相同C. 二硫键 D. 氢键 E. 糖苷键

7. 关于DNA双螺旋结构模型的正确说的是( )

A. dCMP B. dGMP C. dIMP D. dTMP E. dUMP

2. 在RNA水解液中含量最少的是( ) A. AMP B. CMP C. GMP D. TMP E. UMP

3. 核苷酸碱基不含( ) A. C B. H C. N D. O E. P

4. 镰刀形红细胞贫血病属于( ) A. 呼吸性酸中毒 B. 遗传缺陷 C. 自由基破坏 D. 营养不良 E. 低血压

5. 细胞内含量最稳定的成分是( ) A. DNA B. 核糖体 C. 氨基酸 D. ATP E. CoASH

6. 连接核酸结构单位的化学键是( ) A. 肽键

B. 磷酸二酯键

法是( )

A. 是一个三链结构

B. DNA双股链的走向是反向平行的 C. 碱基A和G配对

D. 互补碱基以共价键结合

E. 磷酸戊糖主链位于DNA螺旋内侧 8. 核酸分子储存、传递遗传信息的关键部位是( )

A. 磷酸戊糖 B. 核苷 C. 碱基序列 D. 碱基堆积力 E. 磷酸二酯键

9. 通常核酸

饲用酸化剂在畜禽生产上的应用及其研究进展

来源：《山东饲料》

饲料酸化剂是继抗生素之后,与益生素、酶制剂、香味剂等并列的重要添加剂，是一种无残留、无抗药性、无毒害作用的环保型添加剂。饲用酸化剂作为一种可降低饲料在消化道中的pH值，为动物提供最适消化道环境的新型添加剂，已在国内外得到广泛应用。酸化剂被广泛应用于家禽、仔猪、肉牛、奶牛、羊等动物的饲料中。

1、饲用酸化剂的种类及特性

用作饲料酸化剂的物质有天然和人工合成的，可分为有机酸、无机酸及复合酸化剂。有机酸具有良好的风味，能改善饲料的适口性、参与体内营养物质的代谢等而被广泛应用，但成本较高，有机酸有柠檬酸、延胡索酸、乳酸、异位酸、乙酸、丙酸、甲酸等及其盐类，此外还有苹果酸、山梨酸和琥珀酸。无机酸化剂其酸性强、成本低，生产中也可添加，无机酸化剂包括强酸（如盐酸、硫酸）和弱酸（如磷酸）。复合酸化剂是利用各种有机酸和无机酸按一定比例配合而成，能具有良好的缓冲效果，迅速降低pH值，能降低料肉比，减少营养性腹泻，例如我国首家复合酸化剂—乳香酸主要由乳酸、磷酸、柠檬酸、延胡索酸等组成，异位酸（Isoacids）是较早应用在泌乳牛中的一种有机酸复合物，它是异戊酸、α—甲基丁酸、戊酸、异丁酸的混合物

饲料特别是幼龄动物饲料中添加酸化剂非常普遍，然而行业内对酸化剂作用的认识以及饲料酸化剂产品如何选择存在很多模糊点。本文根据作者自身的理解，就一些常见的问题，阐述观点，供业内朋友分享讨论。

1酸化剂的酸化作用

酸化作用是指酸化剂能解离出氢离子，与碱性物质发生中和反应，可以降低环境的pH值。最初人们在饲料中添加酸

化剂主要是基于这样的考虑：幼龄动物胃酸分泌不足，胃蛋白酶原的激活受阻，影响饲料蛋白质的消化；另外进入十二指肠的食糜较高的pH值，反馈性抑制小肠消化液（胰液和胆汁等）的分泌，从而降低饲料的消化率，并容易引起营养性腹泻。

从这方面考虑，无疑相同摩尔浓度的无机酸（如盐酸、硫酸和磷酸）的酸化作用要强于有机酸，这是因为无机酸的解离程度要高于有机酸。因此最初的酸化剂产品大都以无机酸（磷酸）为主。然而饲料中存在大量的碱性物质（如石粉、磷酸氢钙、以及蛋白质原料等），添加酸化剂根本不足以有效降低饲料本身的pH值，并对采食饲料后胃内食糜的pH产生影响。可见酸化剂的酸化作用效果不会太明显，也因此，无机酸逐渐淡出酸化剂的舞台。而有机酸的盐，特别是强碱盐（如钙盐、钾盐和钠盐）本身呈碱性，因此也没有酸化作用。

解决该问题的办法可以从两个方面入手，第一是配置较低