转录组snp分析

第一章 转录组及转录组测序 第一节 前言

1953年，沃森与克里克对DNA双螺旋结构的精确描绘开创了生命科学的黄金时代，随后如火如荼的开展起来的人类基因组计划建立起庞大复杂的基因组数据库 使人类对了解生命本源和控制生命进程燃起无限憧憬。随着越来越多的基因测序工作渐渐完成，一本“写满生命密码的天书” 呈现在我们面前, 然而，接下来的问题更纷扰而至： 1) 这些基因有什么功能？

2) 不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程？ 3) 基因的表达是如何调控的呢？

4) 基因与基因产物之间是如何相互作用的呢？

5) 相同的基因在不同的细胞内的表达水平有差异吗？

6) 相同的基因处于疾病和治疗状态下的表达水平会有哪些改变？ 如何读懂这本“天书”是目前横亘在科学家们面前严峻的挑战。

因此，在人类基因组项目后，转录组学，蛋白组学，代谢组学等组学不断涌现，生命科学研究已经跨入后基因组时代。其中，转录组学作为一个率先发展起来的学科是研究细胞表型和功能的一个重要手段，转录组高通量测序技术开始在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。

第二节

转录组分析

研究背景：

RNA-Seq是通过结合实验和计算方法来鉴定生物样品中RNA序列的种类和丰度的一种技术。通过RNA-seq，我们就能够确定单链RNA分子中ATCG的顺序。整个过程主要包括：从细胞或组织中提取RNA分子、文库的构建以及后继的生物信息学数据分析。RNA-Seq技术具有许多早期研究方法（如：微阵列）所不具备的优点，如：RNA-Seq平台的高通量、新技术所带来的高灵敏度、发现新转录本、新基因模型以及非编码RNA的能力等。

RNA-Seq技术的到来，使人们认识到，无论是单细胞模式生物还是人类，我们对其转录组的认知异常匮乏。而RNA-Seq产生的新的数据，则可以帮助我们发现基因结构上的巨大差异、鉴定出新的转录本以及能够对small non-coding RNA和lncRNAs有着更好的了解。而且随着测序花费的降低，RNA-Seq的优势体现的更加明显。

服务流程：

样品选取

利用Oligo-dT富集mRNA

mRNA片段化

cDNA合成

末端修复、加polyA、加接头，PCR扩增

数据分析

测序方案：

内容：TotalRNA检测，普通转录组文库构建及测序及信息分析。 测序方式：H

E:\\ > cd e: E:\\

E:\\ > cd plink-1

E:\\plink-1>plink –file test 1. Map 更新

Plink --sheep --file data --update-map position.txt --recode --out data1

Chrnew.txt -- update-chr --recode --out data2 Position: SNP code and position Chrnew：SNP code and Chr. 2．SNP merge

Plink --file data1 --merge data2.ped data2.map --recode --out merge 3．提取SNP位点

Plink --file data --extract 50kSNP.txt --recode --out data1 50kSNP.txt: 50k中的SNP名 4. Quality control

Call rate >98%/99%

Plink --file sheep --geno 0.02 --r

一、生物信息分析流程

获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：

二、项目结果说明

1 原始序列数据

高通量测序(如illumina HiSeqTM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT +

@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF

其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence

Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二

E:\\ > cd e: E:\\

E:\\ > cd plink-1

E:\\plink-1>plink –file test 1. Map 更新

Plink --sheep --file data --update-map position.txt --recode --out data1

Chrnew.txt -- update-chr --recode --out data2 Position: SNP code and position Chrnew：SNP code and Chr. 2．SNP merge

Plink --file data1 --merge data2.ped data2.map --recode --out merge 3．提取SNP位点

Plink --file data --extract 50kSNP.txt --recode --out data1 50kSNP.txt: 50k中的SNP名 4. Quality control

Call rate >98%/99%

Plink --file sheep --geno 0.02 --r

RNA-Seq名词解释

1.index

测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。

2.碱基质量值

（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。

3.Q30

碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。

4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）

每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。计算公式为

公式中，cDNA Fragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数，以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。

5.FC（Fold Change）

即差异表达倍数。

6.FDR（False Discovery Rate）

即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假

一、生物信息分析流程

获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：

二、项目结果说明

1 原始序列数据

高通量测序(如illumina HiSeqTM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT +

@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF

其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence

Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二

蛋白质组与转录组比较关联分析方案

一．概述 1．研究背景

生命体是一个多层次，多功能的复杂结构体系，高通量技术的发展积累了大量的组学数据，这使得由精细的分解研究转向系统的整体研究成为可能，整合多组学数据能够实现对生物系统的全面了解。当部分层面上的研究都逐渐走向完善的时候，从部分到整体就是一种必然发展趋势。

相关研究表明，基因表达不仅仅是从转录组到蛋白质组的单向流动，而是两者的相互连接。对这种功能调控的了解通常只限于特殊的信号途径，要了解转录组和蛋白质组之间的相互调控作用，就需要对RNA和蛋白质的表达进行同步监测。

正如RNA可作为部分生物学功能的酶反应的效益物一样，蛋白质也是大多数生物学功能的效益物。因此，蛋白质水平广泛的基因组分析是基因表达更直接的反映。质谱技术的发展，使得定量的蛋白组学研究成为可能。然而，当细胞适应了转录水平、转录后（如mRNA的剪接）、翻译后（蛋白降解和输出）的精细调控机制后，转录物和蛋白质丰度测量结果可能会不一致。因此，定量的转录物和蛋白质丰度测量可作为相互的标准，为高通量分析得出的基因表达数据做出合理的解释。正如蛋白质和RNA之间类似点可以增加我们对新的生物标记的信任度一样，差异也能暗示我们“其他的转录后调控结合点可

一、生物信息分析流程

获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：

二、项目结果说明

1 原始序列数据

高通量测序(如illumina HiSeqTM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT +

@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF

其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence

Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二

上海敏芯信息科技有限公司

Affymetrix SNP芯片数据分析方案

项目一、基本分析

包括：

芯片原始数据的处理和基因分型，我们给出有统计意义的SNP列表。 描述性统计，如minor allele frequency，Hardy-Weinberg equilibrium等。 显著性检验，实验组与对照组的差异，假阳性率（FDR）的计算等。 SNP的关联分析，建立线性模型或logistic回归模型等。(所有的统计可以选择由SAS，SPSS，或S-Plus/R给出)

项目二、Copy Number Variation（CNV）的计算。

CNV是目前的一个热点研究内容。SNP芯片数据可以用于精确地计算CNV。我们提供针对SNP芯片的基于CNAG(Copy Number Analyser for GeneChip), dChip(DNA-Chip Analyzer)和CNAT(Chromosome Copy Number Analysis Tool)等算法的CNV计算结果。

项目三、SNP注释

通过SNP在染色体上的位置，利用寻找SNP可能影响的基因( or EST)。我们也可以对相应基因进行功能的注释（gene ontology ， pat