毕赤酵母表达系统的优缺点

巴斯德毕赤酵母及启动子

1.1 毕赤酵母表达系统简介

随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。

随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表

很好，需要好好研究一下

原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非 a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案： 1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶； 2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了； 3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。 在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题） 1、制感受态细胞，OD多少比较好？ pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低

2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use

1. 信号肽切割位点和目的基因核苷酸序列5’端的设计酶切位点问题

1.1 目的蛋白N端不要增加氨基酸：a-信号肽在kex2 和ste13处进行切割，

若要目的蛋白不增加额外氨基酸，则需要在kex2对应核苷酸序列前的XhoI作为酶切位点，并补齐信号肽切割所需的序列（酶切位点下游的信号肽对应的核苷酸序列）

1.2 目的蛋白N端可增加氨基酸。则可以选用其他的酶切稳点，保证下游不

出现移码突变就行了。（具体参考具体酶切位点切割点，及其上游核苷酸数有否保证刚好是3的倍数）。

2. 目的基因核苷酸序列3’端的设计酶切位点设计、终止密码子设计 2.1如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；

3. 载体构建问题

3.1 pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选，对于大小

合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的

3.2 pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表。PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp

抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝）， 3.3位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；

3.4虽然α-factor可以

第４０卷第７期

２００９年７月东北农业大学学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔ４０（７）：５５－５９Ｊｕｌｙ２００９Ａ—ｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

宋庆凤，暴立娟，李杰’

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨１５００３０）

摘要：巴斯德毕赤酵母（Ｐ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｒ／ｓ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达栽体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子一ＧＡＰ启动子替换毕赤酵母表达栽体ｐＰＩＣ９上的甲醇诱导型启动子ＡＯＸ，成功构建了毕赤酵母组成型表达栽体ｐＧＡＰＨａ。并以里氏木霉木聚糖酶基因ｘｙｎ２为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现ｘｙｎ２基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽ＩＮＵ替换栽体上原有的ａ—Ｆａｃｔｏｒ信号肽，结果表明，ＩＮＵ信号肽能够有效引导ＸＹＮＩＩ的分泌。

关键词：毕赤酵母；表达裁体；ＧＡＰ启动子；ＩＮＵ信号肽

中图分类号：文献标识码：Ａ文章编号：１００５—９３６９（２００９）０７－００５５－０５

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏ

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白

综述：

基本特征：

作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织

培养等其它真核表达系统更

毕赤酵母表达系统步骤

（参考Invitrogen公司说明书）：

一、 pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存

1 取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2 挑取转化子，甘油保存。 二、 载体构建

1 将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。

2 提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3 载体测序

测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物 三、 线性化DNA

1 提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）； 四、线性化DNA的去磷酸化处理 线性化质粒 43μl CIAP Buffer 5μl

CIAP酶 2μl

四、 总体积为50μl的样品37℃ 1h

篇一：水曲柳、楸木、橡木家具的优缺点

水曲柳家具的优缺点

在如今回归自然、简约古朴的强劲风潮下， 纹理清晰的水曲柳实木家具以朴拙、粗犷的线条设计，再次受到市场关注。相比松木，它坚硬耐磨，不易变形；相比红木，它价格适中，亲民友善。因此，水曲柳家具广受实木家具爱好者的青睐。

水曲柳学名白蜡木，属于木犀科梣属的一种木材，主要产地为我国东北、华北、俄罗斯等地，呈黄白色（边材）或褐色略黄（心材），年轮明显但不均匀，木质结构粗，纹理直，花纹美丽，有光泽，硬度较大。据了解，水曲柳在80-90年代砍伐过度后，数量日趋减少。随着现在市场上的水曲柳的大料越来越少、目前大树已不常见了。

水曲柳原木

水曲柳家具的优点

水曲柳家具的优点一：切面很光滑，油漆和较粘性能也很好。适合干燥气候，且老化极轻微，性能变化小。

水曲柳家具的优点二：水曲柳加工性能很好，能用钉、螺丝及胶水很好的固定,可经染色及抛光而取得很好的表面效果。

水曲柳家具的优点三：水曲柳有着材质坚韧，纹理美丽，还具有极良好的总体强度性能、良好的抗震力和蒸汽弯曲强度，是制作家具的良材。

水曲柳家具的缺点

水曲柳家具的缺点一：水曲柳没有心材抗腐力，白木质易受留粉甲虫及常见家具甲虫蛀食，不易干燥，易产生翘裂。

水曲柳家具的缺点二：水曲柳

随着生活品质的提高,人们也越来越注重舒适家居,不仅要求室内冬暖夏凉,对室内空气质量也有了更高的要求,因此中央新风系统开始受到很多用户的关注。现在市场上的新风系统有顶送风和地送风两种送风方式,很多用户对于地送风新风系统并不是很了解,今天就为大家详细介绍下地送风新风系统。

地送风新风系统优缺点介绍

随着生活品质的提高，人们也越来越注重舒适家居，不仅要求室内冬暖夏凉，对室内空气质量也有了更高的要求，因此中央新风系统开始受到很多用户的关注。现在市场上的新风系统有顶送风和地送风两种送风方式，很多用户对于地送风新风系统并不是很了解，今天就为大家详细介绍下地送风新风系统。

什么是地送风新风系统

地送风新风系统是新风系统的一种形式，最大的不同就在于它的送风方式，地送风新风系统就是地面送风，顶部回风。

地送风新风系统原理

地送风新风系统优点

1. 通风效果好 将新鲜空气由地下送入室内，经过顶部的风口将室内的污浊空气排出室外，新鲜空气和污浊空气不会混杂在一起，完全置换式通风，效果好。

2. 不占层高 地送风地面垫层只需增加30mm高度，不需要吊顶，不占室内层高。

3. 安装简单 地送风一般采用扁形管路，暗埋地面垫层下，随意布置，走向灵活。

随着生活品质的提高,人们也越来越注重舒适家

企业并购的优缺点

并购对于企业来说有利有弊。绿天使并购专家分析汇总了企业并购的优缺点。 一、并购的利，主要是并购可能会增加企业的财富。 例如：

1.并购后的规模经济效益 2.并购可以降低交易费用

3.提供市场份额和市场的竞争力 4.购买被市场低估的企业

5.通过提高被收购企业的管理水平，提高企业的价值

二、并购的弊，主要是由于并购双方信息不对称，而隐含的各种风险及成本。 例如：

1.财务风险——如果，被并购的企业，弄虚作假，美化财务报表，高估企业实际经营能力，低估企业经营成本费用，则并购后，购买方要蒙受损失。 2.资产风险——如果，被并购企业，资产评估数据不真实，资产被高估或者资产权属有争议，则并购后，会影响企业的运营。

3.负债风险——如果，被并购企业，负债很高，并购后，需要偿还的债务也要很高。如果被并购的企业，有很多或有负债，在并购之前没有被发现，并购后将给企业造成很大的财务压力，会影响企业的正常经营。

4.融资风险——如果，现金收购，是需要大量的资金的，企业要有足够的钱和融资能力。 5.法律风险——很多企业不是你想买就能买的，要看政策，买的过程中也许会有法律问题。另外，企业内部很可能存在很多未决诉讼。

6.反收购风险——你想买，需要人家

班级授课的优缺点

班级授课制 （也叫集体教学或课堂教学）

●最早从理论上对班级授课制作阐述的是捷克教育家夸美纽斯的《大教学论》（1632年）

● 我国最早采用班级授课制的是1862年清政府在北京设立的京师同文馆

●1902 年，班级授课制在全国广泛推行，直至现在，它仍是我国各级各类学校教学的基本组织形式。 ●班级授课制的主要优缺点： 班级授课有以下优越性:

第一，一位教师能同时教许多学生，扩大了单个教师的教育能量，有助于提高教学效率。

第二，以“课”为教学活动单元，可使学生的学习循序渐进，系统完整。

第三，由教师设计、组织并上“课”，以教师的系统讲授为主而兼用其他方法，有利于发挥教师的主导作用。

第四，固定的班级人数和统一的时间单位，有利于学校合理安排各科教学的内容和进度并加强教学管理，从而可赢得教学的高速度。 第五，在班集体中学习，学生可与教师、同学进行多向交流，互相影响，互相启发和互相促进，从而增加信息来源或教育影响源。 第六，班集体内的群体活动和交往有利于形成学生互助友爱、公平竞争的态度和集体主义精神，并有利于形成学生其他一些健康的个性

品质。

第七、有利于经济有效地、大面积地培养人才；

第八、有利