实验室培养大肠杆菌的培养基

大肠杆菌培养

一、菌种冻存液的制备

含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80oC冻存。 二、培养基制备

LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）

液体培养基

胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4

固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备

1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。

2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。 3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）

大肠菌群测定的操作细则

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。

1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。

1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂

2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。

2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。

2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。 2.6 生理盐水。

篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲

实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲

实验目的

1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。

2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。

3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。

实验材料

1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。

2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。

实验步骤

1. 培养基灭菌。

在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。既可以通气，又不使细菌进入。)。将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。 同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。

2. 倒平板，倒斜面。

灭菌后。待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。

超净工作台操作：打超净工作台的紫外

实验室用平板培养基配方

1.MRS培养基：

液体：蛋白胨 10g 牛肉膏 10g

柠檬酸铵2g 乙酸钠 5g(无水乙酸钠3g) 酵母粉 5g 葡萄糖 20g 磷酸氢二钾 2g 吐温 1.0ml 盐液甲 5.0ml 蒸馏水： 1000ml 溴甲酚紫 0.8g

[备注]盐液甲的配制：MgSO4.7H2O 11.5g ，MnSO4.4H2O 2.8g

蒸馏水 100ml

固体：在MRS液体培养基中加入1.6%~2%的琼脂

PH=6.5~7.0 121℃灭菌30min

2.YB培养基：

液体:蛋白胨 5g 葡萄糖 5g 酵母粉 5g 磷酸氢二钾4g 3.08%硫酸锰 1.0ml 蒸馏水 1000ml 固体：在YB液体培养基中加入1.4%~1.7%的琼脂 PH=6.0~7.0 121℃灭菌30min

3.PYD培养基：

液体：酵母粉

分子实验室常用的培养基配方,和SDS-PAGE缓冲液配方。

五、实验室常用培养基的配制方法

Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg/ml)

组份浓度 100 mg/ml Ampicillin

配制量 50 ml

配制方法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.用0.22 µm过滤膜过滤除菌。

4.小份分装(1 ml/份)后，-20℃保存。

IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24 mg/ml)

组份浓度 24 mg/mL IPTG

配制量 50 mL

配制方法 1.称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.用0 22 µm过滤膜过滤除菌。

4小份分装(1 ml，份)后，-20℃保存。

X-Gal (20 mg/ml)

组份浓度 20 mg/ml X-Gal

配制量 50 ml

配制方法 1.称量l g X-Gal置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml DMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.小份分装(1 ml/份)后，-20℃避光

大肠杆菌培养操作规程

一、 目的及适用范围

制订本规程的目的为规范大肠杆菌总RNA的制备，保证为诊断试剂产品提供质量可控的质控品及标准品基质。本规程适用于南京实验室提取大肠杆菌总RNA的操作。依照本操作规程，每次可提前大约提取基质液原液2.7ml。

二、 常规时间安排 预计安排 步骤 耗材准备 PBS储存液配置 第一天 培养基配制 灭菌 领取菌种 菌种复苏 第二天 接种 分装培养 RNA完全提取根据需求，自行安排。

三、 培养用耗材准备

1、 锥形瓶、双层铝箔、棉绳

2、 包扎一盒1ml的枪头，50ml康宁冻存管

四、 培养基配制(早上)

培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、 按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中： 例如：配制350mlLB培养基配方如下：[配置双份] 蛋白胨 成分名称 TRYPTONE 称取质量 3.5g 钠 3.5g YEAST XTRACT 1.75g 补足350ml 氯化酵母提取物 去离子水 耗时评估 20min 40min 20min 3h 10min 9h 40min 13h 2、 用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、

完全、溶解。待灭

高中生物实验

生物实验技能考核教案

题 目 《大肠杆菌的分离和培养》教案 学 院___ 化学和生命科学学院 班 级___ 生物科学102班 __ _ _ 姓 名___ 杜艳花__ ___ _ _ 学 号联系电话_ _18758912261（612261） 指导老师 张萍华

日期： 2013 年 7

月 4 日

高中生物实验

《大肠杆菌的分离与培养》教案

一、实验教材分析

本节内容选自浙科版生物选修1第1部分实验1大肠杆菌的分离和培养。本次课程主要包括了本次实验的目的、大肠杆菌的特点、无菌操作和灭菌的方法、仪器设备和实验材料、实验步骤等内容。在前一节介绍了实验室规则和生物技术概况的基础上，进行具体的实验操作。并且经过生物必修三册书本的学习，学生已经掌握了一定的细菌的相关知识，并对一些特殊细菌的筛选和鉴别有了一定的了解。故本次实验教学既是对学生前面学的理论知识的深化，同时也为学生将要学到的分离以尿素为氮源的微生物等内容奠定了比较重要的基础。因此，本节课起着承前启后的重要作用。

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培养基管理规程

1 目的

规范微生物实验室培养基的申购、配制、培养基质量控制、储存、使用、废弃处理等。 2 依据

《药品质量管理规范》、《中国药典》2015年版 四部。 3 范围

适用于微生物实验室检验用的所有培养基。 4 职责

4.1 化验室负责人：监督本规程的实施。 4.2 化验室检验员：按照本规程实施。 5 工具 5.1 定义 培养基 干粉培养基 系指用人工方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配制成的一种混合营养物，用于微生物限度检查、控制菌检查等。 指以干粉形式存在的培养基。 6 内容

6.1 培养基的购买 6.1.1

培养基管理员每月清点干粉培养基的库存量，及时申请购买培养基，以保证实验的

正常进行。 6.1.2

新购进的干粉培养基由培养基管理员验收。验收内容包括：培养基质量检验报告书、

数量，批号、厂家、有效期、包装情况（应包装完整、容器密闭）。若发现包装不完整、不密闭、培养基受潮或物理性状发生了明显改变等应拒绝接收。验收合格后填写《培养基接收记录》，在培养基外部加贴《干粉培养基标签》，填写内容为：名称、接收日期、批号、有效期至、储存条件。

《大肠杆菌的分离和纯培养》的

教学设计

临沂第四中学 张园鞠 2010年7月30日 10:18

一、教材分析

微生物的实验技术是生物学最基本的实验技能，对学生来讲，它是一项实用性很强的实验技能，要求学生能独立完成微生物实验的基本操作，如：微生物实验操作中的灭菌和消毒、接种、培养分离等基本技术。

（一）、教学目标：

1、概述微生物纯培养的基本技术及原理。 2、运用划线接种法，进行微生物的分离和纯培养。 3、运用火焰灼烧法进行灭菌。 4、通过菌落特征的观察，识别微生物

（二）、教学重点

1、微生物分离和纯培养的基础知识 2、平板划线法接种技术 3、火焰灼烧灭菌法

（三）、教学难点

平板划线法接种技术

二、教学过程

这个探究活动，学生是初次接触微生物方面的内容，既不具备相应的基础知识，也缺乏相关的实验技术和操作技能，从教学目标上看，进行微生物的分离和纯培养，属于技能性目标中独立操作水平的要求，根据课标要求，考虑到学生零起点的现状，对教学活动进行如下设计：

课堂导入：展示发霉的馒头和面包给大家看。问：馒头和面包上的斑点是什么？ 答：馒头和面包霉了

（导引目标，激发兴趣。从学生熟悉的生活现象入手，自然引入新的课题。从现实生活入手提出

实验——制备牛肉膏蛋白胨固体培养基、纯化大肠杆菌

1． 在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( )

A．乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌 B．固氮细菌、大肠杆菌、放线菌 C．固氮细菌、霉菌、放线菌

D．固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌 2． 下列关于配制培养基的叙述，正确的是( ) A．制作固体培养基必须加入琼脂 B．加入青霉素可得到放线菌 C．培养自生固氮菌时不需要氮源 D．发酵工程一般用半固体培养基

3． 下列物质中，不能用作酵母菌碳源的是（ ） A．含碳有机物 B．蛋白胨

C．含碳无机物 D．石油、花生粉饼等天然物质

4． 利用稀释涂布平板法纯化的大肠杆菌，经培养后发现培养基上出现了多种菌落，不可能的原因是（ ）

A．培养基制备过程中被杂菌污染 B．接种过程中，无菌操作不符合要求 C．系列稀释时，无菌操作不符合要求 D．由大肠杆菌的种类不同造成的

5． 大肠杆菌能够在哪种培养基上生长繁殖（ ） A．无氮培养基

B．分解尿素的细菌的选择培养基 C．纤维素分解