pcr技术的问题
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PCR问题解析
如何防止PCR形成引物二聚体?
在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,对照marker时都不容易看出其大小,具体是什么原因呢?PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适?
答:1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了,形成引物二聚体的原因很多,如引物设计的不好,在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对;退火温度没有达到最佳,实在不行就做个温度梯度吧;再就是试着改变一下循环数,也许会有帮助。
PCR模板大约在104-106个拷贝。
答2:我觉得是目的条带含量太多了,如果点样太多,负载量太大,就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量,稀释10倍或是减少循环数。
答3:1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法; 2. 可能模板有问题;PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致;
3. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;
4. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的; 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%
PCR过程问题全解
如何防止PCR形成引物二聚体?
在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,对照marker时都不容易看出其大小,具体是什么原因呢?PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适?
答:1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了,形成引物二聚体的原因很多,如引物设计的不好,在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对;退火温度没有达到最佳,实在不行就做个温度梯度吧;再就是试着改变一下循环数,也许会有帮助。
PCR模板大约在104-106个拷贝。
答2:我觉得是目的条带含量太多了,如果点样太多,负载量太大,就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量,稀释10倍或是减少循环数。
答3:1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法; 2. 可能模板有问题;PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致;
3. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;
4. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的; 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的D
PCR技术及其应用
第八章 PCR技术及其应用
PCR技术的建立① Khorana(1971)等提出在体外经 DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—―修复复制”但由于测序和引物合成的困难,以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能,所以,Khorana的 设想被人们遗忘了……
②
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现
Mullis的构思引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
③
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术
Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)100
酶 80 活 性 6040
(%)
20 40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
Kary B. Mullis <
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA
实时荧光定量PCR技术
天为时代核酸系列讲座之院
华中科技大学同济医学
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20
讲 座 提 纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
实时荧光定量PCR 原理常 规 PCR技术:
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术: 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量?
定量原理
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
介绍三个概念: 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图:横坐标:扩增循环数(Cycle);纵坐标:荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
实时荧光定量
实时荧光定量PCR技术
天为时代核酸系列讲座之院
华中科技大学同济医学
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20
讲 座 提 纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
实时荧光定量PCR 原理常 规 PCR技术:
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术: 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量?
定量原理
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
介绍三个概念: 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图:横坐标:扩增循环数(Cycle);纵坐标:荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
实时荧光定量
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA
PCR技术及注意事项
PCR技术应用及注意事项威斯腾生物技术中心 TEL:400 675 6758 2014.9.1
背景
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是一种用于放大扩增特定的 DNA片段的分子生物学技术。
1971 Khorana 等最早提出核酸体外扩增的设想; 1983年Mullis发明并申请专利。
原理
根据DNA的半保留复制。相关酶
双链DNA
单链
DNA聚合酶 碱基互补配对
复制
两分子拷贝。
在体外实验中,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复 性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物, DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
反应体系
缓冲液 4种dNTP混合物(终浓度) 引物(终浓度) 模板DNA Taq DNA聚合酶(耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个 循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。)
Mg2+(终浓度) 双蒸水
步骤
变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR
核酸分子杂交及PCR技术
核酸的分子杂交技术
一、核酸分子杂交
用标记的已知DNA或RNA片段(探针)来检测样品中未知核酸序列,通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合,再经显影或显色的方法,将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列,可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类
液相杂交
核算分子杂交 印记杂交
固相杂交
原位杂交
1.固相杂交:将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上,另一条核酸链游离在液体中。 2.液相杂交:参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型:Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭
缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理 1、变性:
在某些理化因素的作用下,核酸双链分子碱基对的氢键断裂,疏水作用被破坏,双链螺旋或发夹结构被拆开,有规则的空间结构被破坏,形成单链分子,称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素:热、酸、碱、化学试剂(如:尿素、甲酰胺、甲醛等)。 ﹡加热变性是最常用的方法,一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂,双链分开。
﹡变