临床微生物学检验技术实验指导

微生物学实验指导

（怀化学院微生物学课程组）

一、课程性质、地位和作用

微生物学实验是制药工程专业的微生物学课程内实验，为了配合微生物学的教学而开设的。我们将微生物学实验项目按微生物学研究和生产实践程序而构建成一个综合性整体。在这个综合性系统中，包含了要掌握的各项微生物学技术。实验项目保分为验证性实验部分、综合性实验部分、设计性实验部分和研究性实验部分。我们希望通过本实验的教学，培养学生掌握微生物学基本操作技能，具备较强的观察、思考、分析问题的能力，能解决制药工程领域中微生物学研究和生产领域实际问题的基本能力；养成实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。 二、考核方法与要求

1．平时成绩：包括出勤、实验操作，实验效果、讨论情况等，占30% 2．报告成绩：实验报告等，占20%

3．考试成绩：实验操作考试，20%；理论考试，30% 4．综合考核成绩：平时成绩+设计成绩+报告成绩+考试成绩

实验一 培养基的制备与灭菌

一、实验目的

1．掌握培养基配制的原理。

2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、 马铃薯培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

3．了解高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。 二、实验

药品微生物学检验技术

第十二章 药品微生物检验方法验证的意及要求

第一节 药品微生物检验结果的影响因素

微生物的生长受很多因素的影响，特别是药品中污染的微生物尤为如此。药品微生物检验是检测药品中具有繁殖能力的活细胞，这些活的微生物在药品中处于不稳定的状态，它的检出与否受很多因素的影响，主要影响因素有如下几点： 一、供试品组分

由于供试品本身的特性，可能含有具有抑菌作用的组分成分，如抗生素中药中的黄莲、牛黄、冰片等。另外，很多供试品中加入的抑菌剂或防腐剂用于防止供试品中的微生物再污染和再生殖，以及增溶剂、乳化剂、抗氧剂等其他辅料，这些组分在一定浓度下对 微生物具有抑制作用，并可能对 药品中污染的微生物造成不同程度的损伤。供试品中污染的微生物在这些物质的影响下有可能检不出，这时，它们虽然被 抑制甚至受到损伤，但并未死亡，在一定条件在塔门还可以稳定地存活一段时间，当微生物生存环境改变时，如抑菌成分消除或浓度降低时，这些微生物便可以复苏并繁殖，患者使用后同样可危及人体健康。对于这些药品，如按常规方法进行微生物检验，往往显示假阴性结果。

除此之外，在药品微生物检验中，由于原料来源不同，特别是中药制剂，或者生产工艺的差别，使用的辅料不同等原因，使不

微生物学实验指导

华南师范大学生命科学学院

黄文芳 张 松 编著

第一部分 基础实验

实验1 培养基的配制

一、实验目的和内容

目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。

2．高氏1号培养基的配制。 3．马丁氏培养基的配制。 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO423H2O、MgSO427H2O、FeSO427H2O。

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。

三、操作步骤

（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6

1．称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉

微生物学实验指导

华南师范大学生命科学学院

黄文芳 张 松 编著

第一部分 基础实验

实验1 培养基的配制

一、实验目的和内容

目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 内容：1．牛肉膏蛋白陈培养基的配制。

2．高氏1号培养基的配制。 3．马丁氏培养基的配制。 二、实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO423H2O、MgSO427H2O、FeSO427H2O。

试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。

三、操作步骤

（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制

牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，琼脂15～20g，水1000mL，PH7.4～7.6

1．称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉

1．葡萄糖代谢类型鉴别试验（O/F或Hugh－Leifson，HL）

下层：蛋白胨 1克 氯化钠 0．5克

葡萄糖 0.2克 水 100毫升 1.6%溴甲酚紫(Bromo cresol purple)乙醇溶液0.1-0.2mL

PH=7.6 注意: 调完pH值后再加葡萄糖.

(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。

(2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置30℃孵箱孵育48h以上。

(3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为产碱型；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。

(4)应用：主要用于肠杆菌科

实验一 实验室和人体表面微生物的检查

一 实验目的

1 证明实验室环境与体表存在微生物

2 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型 3 体会无菌操作的重要性 二 实验原理

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。 三、器材

1、培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂平板

2、仪器或其他用具 无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤 1、写标签

任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。

注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。 2、实验室细菌检查 （1）空气

将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉

微生物学实验

实验一 实验室环境和人体表面微生物的检查 实验二 油镜的使用和细菌的简单染色 实验三 细菌的革兰氏染色和芽孢染色

实验四 微生物大小的测定和酵母菌死活细胞的鉴定 实验五 培养基的配制与消毒灭菌 实验六 土壤微生物的分离纯化与鉴定 实验七 食品微生物检验 (一)细菌总数测定 实验八 食品微生物检验 （二）大肠菌群数测定 实验九 大肠杆菌生长曲线的测定 实验十 IMViC与硫化氢试验

实验一、实验室环境和人体表微生物的检查

1. 一、目的：

1. 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量与类型； 2. 观察不同类型微生物的菌落形态特征； 3. 体会无菌操作的重要性。

2. 二、原理：

1. 微生物无孔不入，无处不在。

2. 微生物→营养琼脂平板→菌落或菌苔。（37 ℃倒置培养24 h） 3. 描述：菌落的大小、表面光滑或粗糙、干燥或湿润、隆起或扁平、

边缘整齐或锯齿状、菌落透明或不透明、颜色以及质地均匀与否、疏松或紧密等，以便检查环境中细菌的类?秃褪俊?

4. 细胞、放线菌、酵母菌和霉菌四大类型都可能存在，本实验重点观

察细菌。

3. 三、器材：

1. 培养基：营养琼脂平板（牛肉膏蛋白胨培养基）

2. 器具

《微生物学检验》期末考试题-A

一. 名词解释(每题3分 共24分)

1. 菌落2.病毒3.SPA4.溶源性细菌5.非发酵菌6.菌群失调7.选择性培养基8.MIC 二. 单项选择题 (将答案填入表中相应位置，每题1分,共20分) 1.细菌蛋白质合成的场所是

A．中介体 B.质粒 C.核蛋白体 D.线粒体内膜 E.性菌毛 2.细菌细胞壁特有的化学结构是( )

A脂蛋白 B.胆固醇 C.脂多糖 D.肽聚糖 E.磷壁酸 3.细菌内毒素的化学成分是 C

A. 磷壁酸 B.脂蛋白 C.脂多糖 D.细菌素 E.荚膜多糖 4.在下列病原菌中能够产生自溶酶，胆汁溶菌试验阳性的细菌是 C

A. 淋球菌 B.白喉杆菌 C.肺炎链球菌 D.溶血性链球菌 E.结核杆菌 5.BCG是结核分枝杆菌的变异株，它属于

A. 形态变异 B.菌落变异 C.结构变异 D.毒力变异 E.耐药变异 6.用TCBS平板分离培养病原菌是 A

A. 霍乱弧菌 B.结核杆菌 C.痢疾杆菌 D.嗜盐性弧菌 E.非发酵菌 7.用溴麝香草酚蓝作为指示剂的培养基是

A. 尿素培养基 B.MIU培养基 C.O/F培养基 D.糖发

实验一 微生物的分离和纯化

本实验以微生物的分离和纯化为主线，综合包括了培养基的配制、消毒灭菌、微生物的分离等内容，在给定的时间内由学生自主完成。包括以下知识内容。学生书写实验报告的时候，不能照抄袭原文，要用自己的语言，表述实验过程，在别人看完你的实验报告后，能够知道你是怎样做的，能够重复你的实验过程。 一、目的要求

1．了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法。 2．掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。

3 学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 4 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

5 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌及霉等种类的微生物的培养条件。 二、原理

培养基是将微生物生长繁殖所需要各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。其中除含有水分、碳水化合物、含氮化合物和无机盐类。此外，微生物还必须在最合适的酸碱度范围的培养基上生长繁殖，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的PH值范围。根据研究目的不同，可将培养基制成固体、半固体和液体三种形式。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2%的琼脂作凝固剂，半固体培养基则加入0.5～0.8%的琼脂。有时为了特殊

实验须知

普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。

为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项：

1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。

2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。

3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。

5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。

6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。

7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净