重组蛋白纯化中类毒素的过程控制

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

重组蛋白纯化基本策略

捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。 分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。 处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。 在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩G

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化

（一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机

2. 方法

2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20m

中国重组蛋白药物市场报告

1、重组蛋白药物概念（不包含单克隆抗体、疫苗） 重组蛋白质是指利用 DNA 重组技术生产的蛋白质。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体。主要包含细胞因子类药物、单克隆抗体、基因工程疫苗等。 重组药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞表达系统。

目前中国上市的的重组蛋白类药物主要是大肠杆菌生产的细胞因子类药物。

美国在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为主的哺乳动物细胞表达的。 2、中国第一个重组蛋白药物的时间、品种

1993年，我国研制成功第一个重组蛋白药物———干扰素α-1b。 3、中国重组蛋白药物的品种，主要厂家 品种

市场情况

国内主要厂家

重组人生长激素

国内5.4亿人民币

5家，深圳科兴；长春金赛，上海联合赛尔，诺和诺德；安徽安科等

G-CSF

18家，华北制药、长春金赛、北京双鹭、山东齐鲁制药、苏州中凯药业、广西北海方舟药业、上海三维生物技术有限公司等

干扰素INFα

20家，北京三元基因、深圳科兴、上海罗氏、天津华立达的安福隆、上海先灵葆雅等

胰岛素及类似物

中国23亿人民

中国重组蛋白药物市场报告

1、重组蛋白药物概念（不包含单克隆抗体、疫苗） 重组蛋白质是指利用 DNA 重组技术生产的蛋白质。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体。主要包含细胞因子类药物、单克隆抗体、基因工程疫苗等。 重组药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞表达系统。

目前中国上市的的重组蛋白类药物主要是大肠杆菌生产的细胞因子类药物。

美国在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为主的哺乳动物细胞表达的。 2、中国第一个重组蛋白药物的时间、品种

1993年，我国研制成功第一个重组蛋白药物———干扰素α-1b。 3、中国重组蛋白药物的品种，主要厂家 品种

市场情况

国内主要厂家

重组人生长激素

国内5.4亿人民币

5家，深圳科兴；长春金赛，上海联合赛尔，诺和诺德；安徽安科等

G-CSF

18家，华北制药、长春金赛、北京双鹭、山东齐鲁制药、苏州中凯药业、广西北海方舟药业、上海三维生物技术有限公司等

干扰素INFα

20家，北京三元基因、深圳科兴、上海罗氏、天津华立达的安福隆、上海先灵葆雅等

胰岛素及类似物

中国23亿人民

第31卷 第2期2011年2月

北京理工大学学报

TransactionsofBeiinnstituteofTechnolojgIgy

Vol.31 No.2Feb.2011

GST和His标记的重组蛋白制备及

吸附纳米ZnO的研究

()北京化工大学生命科学与技术学院,北京 100029

()摘 要:以p载体为模板人工设计引物,通过P序ET-28a+)CR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine,列的目的基因片段,克隆到原核表达载体p筛选及鉴定阳性重组子p转化E.GEX-4T-3中,GEX-HiscoliBL21细胞后通过I和6聚组氨酸标记的重组蛋白G利用NPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)ST-His得到表达,iNTA系-通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.关键词:谷胱甘肽;6聚组氨酸;基因重组;蛋白表达与纯化;亲和吸附

()中图分类号:Q819 文献标志码:A 文章编号:1001-0645201102-0240-04

/统进行纯化.通过S由LDS-PAGE电泳和Westernblot分析鉴定,C-MSMS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.

宋磊, 陈劲春

Preara

同期控制 什么是程序控制法?就一般而言，管理中采取的控制可以在行动开始之前、进行之中或结后控制。 过程控制束之后进行，称为三种控制模型。第一种称为前馈控制或预先控制，第二种称为过程控制或同期控制，第三种称为反馈控制或事程序控制法即对经常性的重复出现的业务，要求执行人员按规定的标准化程序来完成，以保证业务处理质量达到控制目标和要求。程序控制要求按照牵制的原则进行程序设置，所有的主要业务活动都要建立切实可行的办理程序。即:按生产流程，每道工序的最终点为程序控制点， 每道工序的终点的生产者为质量控制者，对不合格的加工、 不合格的配制有责任也有权提出改正， 这样使每个人在生产过程都受到监控。 程序控制法避免业务工作的无章可循，职责不清，相互推委，有利于及时处理业务和提高工作效率，以及追究有关责任人的责任。 折叠必要性 在讨论计划的种类时，已阐述过程序的概念。程序是对操作或事务处理流程的一种

措述、计划和规定。组织中常见的程序很多，例如决策程序、投资审批程序、主要管理活动的计划与控制程序、会计核算程序、操作程序、工作程序等。凡是连续进行的、由多道工序组成的管理活动或生产技术活动，只要它具有重复发生的性质，就都应当为其制定程序。

(1)程序是一种计划。

同期控制 什么是程序控制法?就一般而言，管理中采取的控制可以在行动开始之前、进行之中或结后控制。 过程控制束之后进行，称为三种控制模型。第一种称为前馈控制或预先控制，第二种称为过程控制或同期控制，第三种称为反馈控制或事程序控制法即对经常性的重复出现的业务，要求执行人员按规定的标准化程序来完成，以保证业务处理质量达到控制目标和要求。程序控制要求按照牵制的原则进行程序设置，所有的主要业务活动都要建立切实可行的办理程序。即:按生产流程，每道工序的最终点为程序控制点， 每道工序的终点的生产者为质量控制者，对不合格的加工、 不合格的配制有责任也有权提出改正， 这样使每个人在生产过程都受到监控。 程序控制法避免业务工作的无章可循，职责不清，相互推委，有利于及时处理业务和提高工作效率，以及追究有关责任人的责任。 折叠必要性 在讨论计划的种类时，已阐述过程序的概念。程序是对操作或事务处理流程的一种

措述、计划和规定。组织中常见的程序很多，例如决策程序、投资审批程序、主要管理活动的计划与控制程序、会计核算程序、操作程序、工作程序等。凡是连续进行的、由多道工序组成的管理活动或生产技术活动，只要它具有重复发生的性质，就都应当为其制定程序。

(1)程序是一种计划。

1.自动化仪表：第一位字母表示被控变量的类别，常见的字母包括T（temperature温度）、P（pressure压力）、dP(differential pressure差压)、F（flow流量）、L（liquid液位或料位）、A（Analysis分析量）、W（weight重量或藏量）、D（density密度）等；后继字母表示仪表功能，值

控制规律 Kc Ti Td P

0.5Kcmax

PI 0.45Kcmax 0.83Pu

PID 0.6Kcmax 0.5Pu 0.12Pu 常见的字母包括T（Transmitters传感变送器）、C（controller控制器）、I（indicator指示仪表）等。

2.

hsp ：设定值（Setpoint sp）也称给定值（Setpoint Value sv），h(被控变量Controlled Variable CV),LT21(液位变送),LC21(液位控制),Q0(Mainpulated Variable MV操作变量),Qi（Disturbance Variable DV扰动变量）

3.被控变