TLC和柱层析的关系

柱层析和TLC操作关键

一、总论

柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术，这两项技术掌握得好，对于提高实验效率、减轻工作量、减少有机溶剂的使用至关重要，对身心健康和环境保护都有明显作用。 1、柱层析

柱层析的关键在于柱子是否装好和洗脱剂是否选择恰当。

在柱层析中由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀(没填严实)，使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。

更多的是层析柱虽然装得不错，但由于淋洗剂选择不恰当，结果导致要分几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。

1) 湿法装柱和干法装柱

不论干法还是湿法，硅胶(固定相)的上表面一定要平整。

湿法装柱：是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。

干法装柱：则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通

柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与 否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶 填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导 致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰 当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东 西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。 由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使 用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。

柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过 TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度 外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析：

装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论 干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般 为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离

硅胶柱层析分离的实验原理、方法与技巧

一、硅胶柱层析原理

硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得

到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物 质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸 过程。

硅胶柱层析流动相

极性小的用乙酸乙酯： 石油醚系统； 极性较大的用甲醇： 氯仿系

统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨 水或冰醋酸

硅胶柱层析惯用方法

1.称量。 200-300 目硅胶，称 30-70 倍于上样量；如果极难分，也可以用 100 倍量的硅胶 H。干硅胶的视密度在 0.4 左右，所以要称 40g 硅胶，用烧杯量 100ml 也可以。

2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。

果洗脱剂是石油醚 /乙酸乙酯 /丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂 是氯仿 /醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水 量太大，尤其是乙酸乙酯 /丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话， 必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去 1% 的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。

3.装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约

如

1/3 体积石油

亲和层析 Affinity Chromatography

一、原理

亲和层析是利用生物大分子所具有的专 一亲和力而设计的纯化技术 寻找配基 配基固定化 制成亲和层析柱

基本过程

固相化

+

吸附+ + 洗 脱

解吸+

载体

样品 固相化

再生

常见具有专一性亲和力的生物分子对：酶： 抗体： 细胞： 核酸： 激素或药物： 外源凝集素： 基质类似物，抑制剂，辅酶 抗原，病毒，细胞 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 受体，载体蛋白 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞

(一) 载体的选择1、载体要求： (1)不溶性 (2)渗透性：疏松网状结构，有良好的液 体流动性 (3)化学和机械性能稳定 (4)具备大量能被活化的基因 (5)抗微生物和酶的侵蚀

2、常用载体(1)纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化 (2)葡聚糖凝胶

特点： 化学及物理性质稳定多孔性比琼脂糖低

(3)琼脂糖凝胶

浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B

凝胶浓度越低结构越疏松 机械强度越低

(4)聚丙烯酰胺凝胶

特点：物理化学性质稳定抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强

学习目标 1.了解纸层析法的基本原理。 2.理解利用氨水使Fe3+, Cu2+显色的

原理。3.熟悉用纸层析法分离溶液中铁离子 和铜离子的操作方法和步骤。

观察与交流: 如何分析下列溶液的成分？方法溶液颜色加氢氧化钠

CuSO4溶液 蓝色 蓝色沉淀与过量氨水生成 深蓝色溶液

FeCl3溶液

棕黄色 红褐色沉淀与氨水生成红褐色沉淀 与KSCN生成血红色溶液

显色反应

如何分离CuCl2与FeCl3混合溶液？

色谱分析法

色谱分析法是一种常用的物质分离分析方

法，常用于分离结构相近、物理性质和化学性质相似物质。 色谱法体系中：一个相是固定不动的，称为固定相； 另一相是移动的，称为流动相; 滤纸或其它载体作为惰性支撑物；

两相在惰性支撑物上作相对运动。

色谱分析法

按流动相和固定相的不同一般分为：气相色谱法和液相色谱法；气相色谱仪

液相色谱仪

气相色谱法的流动相是气体，

液相色谱法的流动相是液体

色谱分析法按吸附剂及其使用形式可分为：

纸层析法

柱层析法

薄层色谱法

柱层析法

知识预备 原理：利用待分离混合物中各组分在某一物质(固定相) 中的亲和性的差异(吸附性差异、溶解性差异),让混 合物溶液(流动相)流经固定相，使混合物在流动相和 固定相之间进行反复吸附和分配等作用，从而使混合物 中

常用试剂配制及显色方法

（一） 通用显色剂 1． 重铬酸钾——硫酸

一般有机物均能显色，不同化合物显示不同颜色。

喷洒剂：5克重铬酸钾溶于100ml，40%硫酸中。喷洒后加热至150oC斑点出现。 2． 碘：检查一般有机物

（1） 碘蒸汽：在一个密闭玻璃皿先放入碘片，使缸内空气被碘蒸气饱和将薄层或纸层

放入缸内数分钟即显色，有时在缸内放一盛水的小杯，增加缸内的湿度，可提高显色的灵敏度。

（2） 0.5%碘的氯仿溶液，取出挥发散过量的碘再喷1%淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。 3． 碘——碘化钾溶液：很我有机物虽黄色（配法见后）。

4． 5%——磷钼酸乙醇溶液：喷后120oC烤，还原性物质显兰色，再用氨气熏，则背景

变为无色。

5． 20%磷酸乙醇溶液：喷后120oC，还原性物质显兰色。

6． 碱性高锰酸钾试剂：还原性物质在淡红背景上显黄色。溶液I:1%高锰酸钾溶液。

溶液II：5%碳酸钠溶液。 溶液I和溶液II等量混合使用。

7． 中性0.05%高锰酸钾溶液：易还原性物质在淡红背景上显黄色。

8． 硝酸银——氢氧化铵（Tollen’s--zoffaronl）试剂，喷后105oC烤5~10分钟，还原性物

质显黑色。

溶液I：0.1N硝酸银溶液。

GDP是一个很好的工具。举例来说，人人都和你讲，别人贪婪的时候你要恐惧呀。可是，冉兰和恐俱怎么量化能？贪婪和恐惧长什么样呢？他是颜值高还是颜值低，这是有谁说了算？假如一件事情无法量化，他就只能成为脍（kuai)灸人口的名言，而无法常委指导实践的公式。

关于贪婪和恐惧的问题，其实答案还是巴菲特回答的。巴菲特说你在分辨市场是否过热的时候要看股市总市值与GDP的比例，例如：2000年美国互联网泡沫没破灭，股市一塌糊涂。当年最热的时候美国股市的总市值是美国总GDP的183%将近了两倍。再往后看，2007年美国房地产泡沫引爆的次贷危机，导致楼市、股市遭遇大幅下跌，当时在泡沫高点，股市的市值跟美国经济GDP的比重达到了134%。反观中国，2007年上证指数为6142点那一天我们的A股总市值是28万亿，而可比同期中国GDP是21万亿，这个比值达到了136.6%也大幅超过了100%。再看2015年上证指数为5178点，当天的A股总市值是77万亿，同期可比2014年GDP是63万亿我们的股市市值已经是经济的120%以上了，这是明显的泡沫！所以，经济规律是没有国界的，当股市市值与GDP的比重超过100%，泡沫就会出现，当市值与GDP的比重达到

免疫层析实验

1．原理

金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。本项技是将各种反应试剂分点固定在试纸条 上，检测标本加在试纸条的一端，通过毛细血管作用使样品溶液在层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成的复合物被 富集或固定在层析条上的特定区域（检测线），通过标记免疫技术显色。本项技术的特点是可进行单份标本检测且简便、快速、不需任何仪器设备，因此，发展非常 迅速。

DICA也是GICA（goldimmunochromatography assay）GICA试剂为试纸条形式。在以塑料条上依次黏贴上以下几种组分，1--吸水纸，2--破璃纤维膜，抹上固定着干燥的金标抗体，3--硝酸纤维素膜，膜上包被着线条状抗体，4--吸水纸。

因为1，4都是吸水纸，由于吸水作用， 一，使样品液从1端向4端移动

二，当样品液达到2时，金标抗体被溶解，同时与标本中的抗原反应形成复合物 三，样品液继续移动至3 时，金标记的抗体复合物与膜上的抗体结合，呈现红色的线条

四，多余的金条抗体继

元器件交易网http://www.77cn.com.cn

IMPORTANT NOTICE

Texas Instruments and its subsidiaries (TI) reserve the right to make changes to their products or to discontinue

any product or service without notice, and advise customers to obtain the latest version of relevant information

to verify, before placing orders, that information being relied on is current and complete. All products are sold

subject to the terms and conditions of sale supplied at the time of order acknowledgement, including those

pertaining to warranty, patent infringeme

Capto MMC

皇家药院

Captor MMC是一种耐盐的多模式的生物处理媒介，在使用填充床色谱法从大量的培养液中纯化蛋白质时可以作为捕获介质和中间纯化介质。Capto MMC在提高生产力的同时降低了生产成本：在高电导率下具有很高的动态载量；高容量的吞吐量；新的选择性；更小的操作单元。

1 生物处理媒介

生物处理媒介因为生产规模的色谱层析而得到发展。所有的生物处理媒介均经验证方法进行生产，并且经过测试以满足生产的需求。安全的订购和交付模式能够为规模生产需要的媒介提供可靠的供应。法规支持文件(RSF)可用来协助工艺验证和提交给监管机构。生物处理媒介可以覆盖从捕获到精纯的所有纯化步骤。

2 Capto MMC的特性

Capto MMC 具有多种官能团的配体，多种作用方式的官能团使配体具有不同于传统离子交换剂的选择性，且在高盐条件下仍具有结合蛋白质的活性。

Capto MMC与大分子间存在多种作用方式，其中最显著就是离子作用，氢键和疏水作用。

Capto MMC是为了提高介质在捕获和中间纯化步骤中的速度和通量而设计的。通过提高高盐浓度下的容量和低反压条件下的流速，而减短生产周期和提供生产力。

该媒介以高流速的琼脂糖为基质，典型