蛋白质含量测定方法及优缺点

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7

黄豆中蛋白质含量测定——凯氏定氮法

一、仪器和试剂 主要仪器:

定氮仪。

试剂（除注明外均为分析纯）： 1. 浓硫酸。

2. 30%氢氧化钠溶液。 3. 2～4%硼酸溶液。 4. 0.1mol/L盐酸溶液。

5. 催化剂：硫酸钾——硫酸铜的混合物（K2SO4:CuSO4·5H2O=3.5g:0.1g）。 二、操作步骤 1. 消化

准确称取粉碎均匀的黄豆粉0.5g左右，小心移入干燥的消化瓶中（注意用称量纸将样品加入到消化管底部，勿粘附在瓶壁上），加入适量催化剂及10mL浓硫酸，按要求安装好消化装置后,设置好消化程序,打开冷凝水, 开始消化程序。(160℃, 40min; 250℃, 20min; 350℃, 60min; 420℃, 30min)消化程序结束后，消化至溶液透明呈蓝绿色，冷却至室温。同时做空白对照。 2． 蒸馏、吸收及滴定

按要求安装好UDK142蒸馏仪，并将蒸馏仪与自动电位滴定仪连接好。将所需试剂装到相应的试剂瓶中。设置好蒸馏程序及滴定程序后，将冷却好的消化管装到蒸馏仪上，打开冷凝水，然后开始程序。 三、结果计算

X?(V1?V2)?c?0.0140?F?100mX ——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g） C

蛋白质各种定量方法的优缺点的比较

1．蛋白质的常规检测方法

1.1 凯氏（Kjeldahl）定氮法

一种最经典的蛋白质检测方法。

原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨

又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好 缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大

1.2 双缩脲法

常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。

原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是 3 分子的脲经180℃左右加热，放出1分子氨后得到

的产物。 在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。

测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg）

优点：较快速，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近 缺点：①灵敏度差；

② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

1.3 Folin-酚试剂法

原理：Folin-酚法的原理与双缩脲法大体相同，利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。同时也由于

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(micro Kjeldahl method)

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.

实验原理

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下： 1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3. 滴定：用过量标准HCl吸收

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(micro Kjeldahl method)

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.

实验原理

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下： 1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3. 滴定：用过量标准HCl吸收

实验一 蛋白质含量测定方法的研究

生物093 孙文雅 0902040306

一、研究背景

蛋白质是存在于生物体中的一类重要的生物大分子物质，其结构及功能的多样性决定了它在生命活动的各个领域中都有极其重要的作用。因此，对于探究生命活动的奥秘，首先要明确的内容之一即是生命活动的主要承担者-----蛋白质的结构与功能与生命活动的内在联系。蛋白质含量测定技术是蛋白质分离提纯流程中的基本环节。缺少这一技术的辅助，我们就无法明确得知某种蛋白质的存在，也就无法完成分离提纯的最终目的。

目前，测定蛋白质含量的方法主要有四种：Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法、紫外法以及凯氏定氮法，其中最常用的是前三种。

然而为什么对同一类甚至同一种物质的测定会存在多种不同的方法呢？通常情况下，技术及方法的发展依赖于人们的需求，如果一种方法即可满足人们对于蛋白质含量测定的需要，那么其他的方法也就没有其存在的必要性了；也就是说，如果多种测定方法并存而且同时为人们所用，那么就说明仅仅一种方法并不能满足人们对于蛋白质含量测定的需要，每一种方法必然都有其特殊的适用范围及缺陷。

那么，面对多种方法，我们在实际工作中又要如何进行选择呢？选择的依据又是什么呢？首先考

黄豆中蛋白质含量测定——凯氏定氮法

一、仪器和试剂 主要仪器:

定氮仪。

试剂（除注明外均为分析纯）： 1. 浓硫酸。

2. 30%氢氧化钠溶液。 3. 2～4%硼酸溶液。 4. 0.1mol/L盐酸溶液。

5. 催化剂：硫酸钾——硫酸铜的混合物（K2SO4:CuSO4·5H2O=3.5g:0.1g）。 二、操作步骤 1. 消化

准确称取粉碎均匀的黄豆粉0.5g左右，小心移入干燥的消化瓶中（注意用称量纸将样品加入到消化管底部，勿粘附在瓶壁上），加入适量催化剂及10mL浓硫酸，按要求安装好消化装置后,设置好消化程序,打开冷凝水, 开始消化程序。(160℃, 40min; 250℃, 20min; 350℃, 60min; 420℃, 30min)消化程序结束后，消化至溶液透明呈蓝绿色，冷却至室温。同时做空白对照。 2． 蒸馏、吸收及滴定

按要求安装好UDK142蒸馏仪，并将蒸馏仪与自动电位滴定仪连接好。将所需试剂装到相应的试剂瓶中。设置好蒸馏程序及滴定程序后，将冷却好的消化管装到蒸馏仪上，打开冷凝水，然后开始程序。 三、结果计算

X?(V1?V2)?c?0.0140?F?100mX ——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g） C

实验八、蛋白质含量的测定

教学目的要求： 基本知识点

?1、掌握凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。

?2、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?3、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 ?4、掌数据处理和结果计算技术。

重点

?1、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?2、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 难点

凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。 课时教学方案： 复习与提问：

?1、检查实验准备情况，

?（1）实验内容；

?（2）实验仪器与试剂有哪些？

?（3）凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质程序。 ?2、凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理。 ?3、样品消化时应注意的事项。

?4、龙科－A型K氏定氮仪的工作原理与蒸馏操作方法。

实验八、蛋白质含量的测定

一、实验目的

1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质的原理；

2、熟悉凯氏定氮法中样品的消化、蒸馏、吸收等基本操作技能； 3、熟练称量、溶液转移、滴定等基本操作技能。 二、实验原理

食品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2

及H20逸去而氮以氨的形式与硫酸

半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

(一)方法原理

样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。

(二) 仪器、设备

1. 仪器

分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升, 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。

2. 试剂

(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；

(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；

(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；

(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克, 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合, 用稀酸或稀碱调节PH值为

4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在1个月之内使用；

(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克, 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨, 仔细混匀,