病毒TCID50的测定方法

病毒TCID50测定

操作步骤 (1) 准备细胞

取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细 胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。 (2) 稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法 B法参照书将液体量减少后的结果

病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500μl，即10-1为50μl加入450μl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100μl加入900μl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液

TCID50测定方案

2012112339

1 简介

TCID50(Tissue Culture Infective Dose)，半数组织培养感染量，又称50%组织细胞感染量，指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(Cytopathic effect，CPE)的病毒量。

将不同稀释度的病毒接种到96孔板上培养的单层细胞上。观察细胞病变，待细胞不再病变时记录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数，按照Reed-Muench公式计算TCID50值。

2 试剂

试剂

DMEM-basic培养基 胰蛋白酶

胎牛血清Fetal bovine serum PBS

来源 Gibco，上海 Gibco， Hyclone， Hyclone，

保存条件 4℃保存 -20℃冻存 -20℃冻存 -20℃冻存

3 仪器与耗材

仪器

CO2培养箱 生物安全柜 倒置显微镜 显微照相系统 高速冷冻离心机 电子天平 移液器 液氮罐 电冰箱

规格

耗材 细胞培养瓶 无菌离心管 一次性移液管 细胞培养板

规格

25cm2

15mL，50mL

1mL，2mL，5mL，10mL 96孔

4 细胞及培养基

DF-1细胞株

细胞

实验 病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

滴度：在半定量或定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱。 滴度（抗体的多少）越高，受传染的机会就越小。

一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测

半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测

三、材料

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） TCID50的操作步骤

1) 准备细胞

取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细

胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层

病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

概念：半数感染量（median infective dose， ID50） 表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测

蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测 三、材料

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） 四、TCID50的操作步骤

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl

病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

概念：半数感染量（median infective dose， ID50） 表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测

蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测 三、材料

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） 四、TCID50的操作步骤

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl

1、PFU:plaque forming unit，空斑形成单位：感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。因此建议也可使用TCID50法。

2、MOI :multiplicity of infection，感染复数：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。

然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。其公式为：

P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。 其中

中和试验

动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验

(Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。

中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合；然后把血清－病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。中和反应不仅能定性而且能定量，故中和试验可应用于：

1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的

毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。

2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间

较长。动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。

3.分析病毒的抗原性。

毒素和抗毒素亦可进行中和

普鲁卡因中毒概述（普鲁卡因中毒是什么病？）：

普鲁卡因中毒是由于麻醉或静脉滴注用普鲁卡因过量所致。 普鲁卡因中毒症状体征（普鲁卡因中毒症状是什么？）：

体检注意意识、瞳孔、脉搏、呼吸、血压等变化，随时注意有无循环衰竭症状。 普鲁卡因中毒诊断检查（确诊普鲁卡因中毒需要做什么检查？）： 麻醉或静脉滴注用药过量史,结合临床表现。

普鲁卡因中毒治疗方案（普鲁卡因中毒如何治疗？）： 1.立即停止用药。

2.给予氧及5％二氧化碳混合吸入或人工呼吸。

3.氯化琥珀胆碱10～15mg缓慢静注，可控制抽搐。禁用中枢兴奋剂。

4.有严重惊厥者首先给氧人工呼吸纠正缺氧，同时选用硫喷妥钠0.5g加生理盐水25ml缓慢静注，亦可用地西泮(安定)10～20mg或阿米妥钠0.3～0.5g缓慢静注或肌注。 5.大量维生素C静滴，以加速其分解。

6.有正铁血红蛋白血症，可选用1％美蓝(亚甲蓝)25～50ml，以葡萄糖溶液稀释后缓慢静注。 7.普鲁卡因过敏性休克者：给氧，予肾上腺素或糖皮质激素。 普鲁卡因中毒预防及预后（如何预防普鲁卡因中毒？）： 使用普鲁卡因药物时注意其剂量。

普鲁卡因中毒注意事项（普鲁卡因中毒应该注意什么？）：

给予氯化琥珀控制抽搐，禁用中枢兴奋

普鲁卡因中毒概述（普鲁卡因中毒是什么病？）：

普鲁卡因中毒是由于麻醉或静脉滴注用普鲁卡因过量所致。 普鲁卡因中毒症状体征（普鲁卡因中毒症状是什么？）：

体检注意意识、瞳孔、脉搏、呼吸、血压等变化，随时注意有无循环衰竭症状。 普鲁卡因中毒诊断检查（确诊普鲁卡因中毒需要做什么检查？）： 麻醉或静脉滴注用药过量史,结合临床表现。

普鲁卡因中毒治疗方案（普鲁卡因中毒如何治疗？）： 1.立即停止用药。

2.给予氧及5％二氧化碳混合吸入或人工呼吸。

3.氯化琥珀胆碱10～15mg缓慢静注，可控制抽搐。禁用中枢兴奋剂。

4.有严重惊厥者首先给氧人工呼吸纠正缺氧，同时选用硫喷妥钠0.5g加生理盐水25ml缓慢静注，亦可用地西泮(安定)10～20mg或阿米妥钠0.3～0.5g缓慢静注或肌注。 5.大量维生素C静滴，以加速其分解。

6.有正铁血红蛋白血症，可选用1％美蓝(亚甲蓝)25～50ml，以葡萄糖溶液稀释后缓慢静注。 7.普鲁卡因过敏性休克者：给氧，予肾上腺素或糖皮质激素。 普鲁卡因中毒预防及预后（如何预防普鲁卡因中毒？）： 使用普鲁卡因药物时注意其剂量。

普鲁卡因中毒注意事项（普鲁卡因中毒应该注意什么？）：

给予氯化琥珀控制抽搐，禁用中枢兴奋

COD的测定方法

COD（Chemical Oxygen Demand）（化学需氧量）是水中有机物消耗氧的含量，是反应废水污染程度的重要指标之一，是水质监测的重中之重，与我们的生活息息相关。

化学需氧量COD是在一定的条件下，采用一定的强氧化剂处理水样时，所消耗的氧化剂量。它是表示水中还原性物质多少的一个指标。水中的还原性物质有各种有机物、亚硝酸盐、硫化物、亚铁盐等。但主要的是有机物。因此，化学需氧量（COD）又往往作为衡量水中有机物质含量多少的指标。化学需氧量越大，说明水体受有机物的污染越严重。

化学需氧量（COD）的测定，随着测定水样中还原性物质以及测定方法的不同，其测定值也有不同。目前应用最普遍的是酸性高锰酸钾氧化法与重铬酸钾氧化法。

高锰酸钾（KMnO4）法，氧化率较低，但比较简便，在测定水样中有机物含量的相对比较值及清洁地表水和地下水水样时，可以采用。重铬酸钾（K2Cr2O7）法，氧化率高，再现性好，适用于废水监测中测定水样中有机物的总量。 有机物对工业水系统的危害很大。含有大量的有机物的水在通过除盐系统时会污染离子交换树脂，特别容易污染阴离子交换树脂，使树脂交换能力降低。有机物在经过预处理时（混凝、澄清和过滤），约可减少50%，