噬菌体的分离与纯化实验报告

噬菌体的分离与纯化

（小组成员：宋淑芳、项媛媛、谢坤、陈金杰、陶思凡）

一、实验目的

学习分离纯化噬菌体的基本原理和方法，观察噬菌斑 二、实验原理

噬菌体感染宿主细胞后，其DNA（或RNA）在细胞体内进行复制、转录，相关基因表达，装配成完整的噬菌体颗粒，最后裂解宿主细胞或通过挤出方式从宿主细胞（宿主细胞不被杀死，如M1噬菌体）中释放出来。因此，①在液体培养基中可使浑浊的菌悬液变为清亮或较清亮。利用噬菌体的这种特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基混合后培养，噬菌体便能大量增殖，释放，从而可分离到特定的噬菌体。②在有宿主细菌生长的软琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被染细菌的生长，形成透明的或浑浊的空斑，亦称噬菌斑。一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这种现象可将分离获得的噬菌体进行纯化。 三、实验用具及材料

1.菌种：大肠杆菌 2.试剂：氯仿 3.培养基：

液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g，NaCl 1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；

3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏 0.9g，NaCl 1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；

固体牛肉膏培养基：每100m

噬菌体的分离与纯化

实验用具及材料

1.菌种：大肠杆菌 2.试剂：氯仿 3.培养基：

1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g，NaCl 1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； 2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏 0.9g，NaCl 1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； 3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；

4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌

4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌

细菌过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等 实验步骤

1.噬菌体的分离

（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔

1）

接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。

（2）增殖培养：在盛有10mL 3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基

大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3m

第三章 噬菌体载体

一、填空题

1． 噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因： 一是—-----------—；二是----------——。

2． 第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。

3． λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。它有一个复制起点，进行—-------—向复制。λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。

4． 根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。

5． 野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和-------------

生命科学学院 病毒生物学 λ 噬 菌 体 综 述 摘要：噬菌体是一类温和噬菌体，它们感染大肠杆菌后能进行溶菌性生长(Lytic growth)和溶源性生长(Lysogenic growth)。其溶源特性对基因重组与遗传工程研究有很大帮助。本文就λ噬菌体的基因组结构、溶源化状态的建立 和基因工程应用做简要的综述，分析存在的问题，并对研究方向进行了展望。 病毒生物学

关键词：λ噬菌体 溶原性 溶菌性 基因克隆 引言：

大肠杆菌噬菌体λ为长尾噬菌体科，是一类中等大小的大肠杆菌病毒，其基因组为双链线状DNA，由48502对碱基组成，分子量3.2×107 ，约50个基因，特点是相关基因成簇排列，形成若干个操纵子。基因组两端为粘性末端，中间有相当长的DNA片段是裂解生长非必需的，这就为其作为外源基因的克隆载体提供了方便。

λ噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。感染时吸附位点为细胞壁。属温和性感染；感染的DNA环化并整合于宿主基因组中。以θ环双向复制，然后通过滚环机制单向复制。用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 1、The discovery of bacterioph

噬菌体的发现和研究历史 噬菌体

噬菌体（Bacteriophage）是一类侵害细菌（包括放线菌、真菌和原核生物）的病毒，又称细菌病毒（bacterialvirus）。具有其它病毒的共同特性：个体小、可通过除菌滤器、没有细胞结构、非常专一的寄生性等，为非细胞生物。其结构主要由蛋白质和核酸（DNA或RNA）组成。在自然界中分布广泛，土壤、空气、水中或生物体内都可存在。据噬菌体与宿主细胞的关系可分为烈性噬菌体

（virulent phage）和温和噬菌体（temperate phage）两类。前者改变宿主的性质，大量产生新的噬菌体，最后导致菌体裂解死亡；后者可因生长条件的不同，即可引起宿主细胞的裂解死亡，又可将其核酸整合到细菌的染色体上，使细菌细胞继续生长繁殖，并被溶原化。据噬菌体的核酸类型、粒子形状和有无囊膜存在，可将其分为12个科。 噬菌体的危害

主要存在于发酵工业。如乳制品、酶制剂、氨基酸、有机溶剂、抗生素、微生物农药和菌肥生产等。一旦发生噬菌体污染，会导致发酵异常、倒罐,使工业生产遭到严重损失。

噬菌体的应用

1. 用于鉴定细菌的分型；

2. 分子生物学领域的重要实验工 具和最理想的材料；

3. 用于预防和治疗传染性疾病； 4.

λ噬菌体的基因调控

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目录

λ噬菌体的发现 λ噬菌体的结构组成

1. 基本结构 2. λ噬菌体的核心

λ噬菌体的生活周期

I． II．

两种发育途径简介 调控发育途径的分子基础

1. 两种途径共同的早期基因表达途径 2. 溶源发育中基因的相互作用 3. 裂解途径的建立 4. 溶源和裂解的平衡 5. 溶源发育向裂解发育的转变

λ噬菌体的侵染过程

1. 吸附 2. 穿入 3. 生物合成 4. 成熟与释放

λ噬菌体的应用

1. 细菌的鉴定与分型 2. 耐药细菌感染的治疗 3. 分子生物学研究的重要工具 4. 遗传工程 5. 其他

参考文献

λ噬菌体的发现：

1951年J. Lederberg的妻子Esther Lederberg证明了J. Lederberg和Tatum用来杂交的K12中有原噬菌体，并命名为λ，经10年的研究搞清了溶原化的实质。

在E.coli K12中是有原噬菌体的存在。Jacob和Wollman（1956年）发现了合子诱导（zygotic induction）现象，并利用合子诱导确定了

病毒生物学

生命科学学院

λ噬菌体的裂解性和溶原性的基因调控机制

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第1页

病毒生物学

摘要

λ

噬菌体（phage）有两种生存策略，一种通过感染宿主细胞，产生大量

的子代噬菌体，同时宿主细胞裂解死亡，这种方式称为裂解性感染。另一种是噬菌体的基因组以一种原噬菌体的方式潜伏于细菌中，这种增值方式称为溶原态（lysogeny）。λ

噬菌体的裂解发育、溶原发育和溶原发育到裂解发育的诱

导是研究生物分子调节优异的模型。经过四十多年的研究，在这个模型中已经发现了众多的正调节因子和负调节因子在转录水平或转录后调节基因的表达。

关键词: λ噬菌体、裂解性、溶原性

目录

1.摘要 ......................................................................................................................................... 2 2. λ噬菌体的结构组成 ..............................................................................

中国生物制品学杂志2012年5月第25卷第5期Chin J Biologicals May 2012，Vol.25No.5

噬菌体（Bacteriophage ）是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等的微生物的总称，以细菌为宿主进行

复制和繁殖。噬菌体裂解酶（Bacteriophage lysins ）是噬菌体在感细菌后期表达的一类细胞壁水解酶，该酶通过水解氨基糖之间的糖苷键、细胞壁肽聚糖上的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连接键，达到裂解细菌的目的，然后释放出子代噬菌体，用于感染其他细菌。

1.噬菌体及其裂解酶

噬菌体是一种特异性感染细菌的病毒，在地球上分布非常广泛，分别由英国的Twort 和法国的D ′Herelle 在1915年和1917年独立发现［1-2］。噬菌体根据核酸的特点，可以分为单链RNA 噬菌体、双链RNA 噬菌体、单链DNA 噬菌体和双链DNA 噬菌体。噬菌体在宿主菌体内复制产生子代噬菌体，为了释放子代噬菌体，在数百万年间，噬菌体进化出了高效裂解细菌系统。小分子噬菌体（ssRNA 和ssDNA ）通过编码噬菌体相关蛋白作用于肽聚糖合成酶，从而干扰宿主菌的细胞壁的生物合成；大分子噬菌体（dsDNA ）则进化出高效的裂解酶系统，特异性地作用于细

M13噬菌体

M13 phage

一种丝状噬菌体，可感染含F因子的大肠杆菌细胞。 遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）

M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6407

个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。M13DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突

变、缺失活插入外源DNA片段，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。

其中M13mp系列对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和 LacZ基因，可容纳外源DNA300-400bp，可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针。

它是一种质粒载体。

M13噬菌体在感染雄性大肠杆菌（F+或Hfr）时，都是以一端吸附在F型菌毛的顶端，所以称为F特异性丝状噬菌体。而对雌性大肠杆菌（F-）不敏感。所以Hfr型的大肠杆菌和携带F'质粒的大肠杆菌都能被感染

相关应用配置：M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒

相关例子：兔抗M13噬菌体酶标抗体的制备，M13噬菌体已被广泛地应用于噬菌体展示技术。M13的酶标抗体,是在噬菌体展示技术筛选结果ELISA检测中不可缺少的试剂。我们制备了兔抗M

血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析

【实验目的】

1、了解蛋白质分离提纯的总体思路。

2、掌握盐析法、凝胶层析法和离子交换层析的实验原理及操作技术 3、掌握电泳法分离纯化蛋白质的方法。

【实验原理】

1、蛋白质的粗提——盐析法 胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒子使蛋白质周围的水化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的一种。向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。盐析不能使蛋白质变性，可以复原。利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，蛋白质溶解度更加降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫