质粒DNA的限制性内切酶消化

遗传分子生物学实验

质粒DNA DNA的限制性内切酶酶切 实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切

遗传分子生物学实验

一 实验目的了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 DNA

限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 DNA DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 水解酶 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 重组中重要的工具

遗传分子生物学实验

第一类( 第一类(I型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链， DNA分子中的双链 有专一性，是随机的。这类限制性内切

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常用的限制性内切酶

内切酶 ApaⅠ BamHⅠ BanⅡ HgiJⅡ BciT130Ⅰ M. EcoRⅡ MvaⅠ BstOⅠ BglⅠ BglⅡ BmgT120Ⅰ AsuⅠ Cfr13Ⅰ Sau96Ⅰ BmeT110 AvaⅠ BseJⅠ BspT104Ⅰ AsuⅡ NspⅤ BstBⅠ Csp45Ⅰ BspT107Ⅰ HgiCⅠ BanⅠ BstPⅠ BstEⅡ EcoO65Ⅰ Eco91Ⅰ DraⅠ AhaⅢ Eco24Ⅰ Eco72Ⅰ Eco88Ⅰ EcoO109Ⅰ DraⅡ 酶切位点 GGGCCC CCCGGG GGATCC CCTAGG G(A/G)GC(TC)C C(T/C)CG(A/G)G CC(A/T)GG GG(T/A)CC GCCNNNNNGGC CGGNNNNNCCG AGATCT TCTAGA GGNCC CCNGG C(T/C)CG(A/G)G G(A/G)GC(T/C)C GATNNNNATC CTANNNNTAG TaKaRa 2000 U/120元 2000 U/120元 500 U/120元 MBI TOYOBO 1500 U/120元 600 U/120元 500 U/120元

常用的限制性内切酶

内切酶 ApaⅠ BamHⅠ BanⅡ HgiJⅡ BciT130Ⅰ M. EcoRⅡ MvaⅠ BstOⅠ BglⅠ BglⅡ BmgT120Ⅰ AsuⅠ Cfr13Ⅰ Sau96Ⅰ BmeT110 AvaⅠ BseJⅠ BspT104Ⅰ AsuⅡ NspⅤ BstBⅠ Csp45Ⅰ BspT107Ⅰ HgiCⅠ BanⅠ BstPⅠ BstEⅡ EcoO65Ⅰ Eco91Ⅰ DraⅠ AhaⅢ Eco24Ⅰ Eco72Ⅰ Eco88Ⅰ EcoO109Ⅰ DraⅡ 酶切位点 GGGCCC CCCGGG GGATCC CCTAGG G(A/G)GC(TC)C C(T/C)CG(A/G)G CC(A/T)GG GG(T/A)CC GCCNNNNNGGC CGGNNNNNCCG AGATCT TCTAGA GGNCC CCNGG C(T/C)CG(A/G)G G(A/G)GC(T/C)C GATNNNNATC CTANNNNTAG TaKaRa 2000 U/120元 2000 U/120元 500 U/120元 MBI TOYOBO 1500 U/120元 600 U/120元 500 U/120元

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实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖电泳

一、实验目的

掌握DNA的限制性酶切的基本原理 和琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术

二、实验原理 1、DNA的限制性酶切

限制性内切酶是基因操作中不可缺少的工具酶，它能够识别双链DNA的特定位点并切开DNA，这个特定位点是一段具有旋转对称结构的DNA片段。。

绝大多数的限制酶识别长度为4~8个核苷酸且呈二重对称的特异序列。EcoRI的识别序列是G↓AATTC，BmHI的识别序列是G↓GATCC，HindIII的识别序列是A↓AGCTT。

每种限制性内切酶都有特定的反应条件，如特定的pH范围，缓冲液组分，温育温度等，具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。一般温度37℃，pH7.5~8.0对大多数酶来讲是适合的，但缓冲液的组分则变化很大，典型的组分应有Tris、NaCl、MgCl2，和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。

典型的反应体系中包括lμg或更少的DNA和1单位酶以及合适的反应介质。反应总体积通常控制在20和50μ之间，反应时间在1小时，而反应的终止则由EDTA溶液的加入完成，因为它能鳌合核酸酶活性所必需的金属离子。

2、DNA的琼脂糖电泳

DNA的电泳有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳，它

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1.PCR(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DN

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1.PCR(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DN

质粒DNA的提取、定量、 酶切与PCR鉴定

一、实验流程简述实验内容流程 ↓ 质粒DNA提取(约1小时) ↓ 紫外检测定量知识(计算方法),步骤 ↓ 紫外检测定量 ↓ 酶切步骤 ↓ 酶切约1~2小时 ↓ 学习酶切原理，琼脂糖电泳原理 ↓ 电泳(样品：质粒DNA,酶切产物，Marker) ↓约30分钟 观察电泳结果、记录、拍照、保存

二、实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法 了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原 理和测定方法 了解质粒酶切鉴定原理 学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的 构型、分子量的大小

质粒DNA的提取与定量Extraction and Quantitation of Plasmid DNA

一、什么是质粒？ 独立于细菌染色体 以外，能独立自主 复制的闭合环状 DNA分子；

基因工程常采用的 载体

方法：碱裂解法； 煮沸裂解； 羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法； 酸酚法 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行 处理及用加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离、纯化质粒DNA

二、实验原理基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的 差