inoue制备感受态原理

1试剂的配制

⑴ 5mol/L的KOH: 10mL

称取KOH（南京化学试剂有限公司）2.8055g 加无菌的Mill-Q水至10mL ⑵ 0.5mol/L的PIPES pH:6.7

称取PIPES固体（进口Sigma）3.775g 加无菌的Mill-Q水至25 mL 用5mol/L的KOH调pH至6.7 并过滤除菌。 ⑶ Inoue转化缓冲液的配制：500mL

试剂 需要量/500mL 终浓度 MnCl2.4H2O（国药集团化学试剂有限公司） 5.44g 55mmol/L CaCl2.2H2O （AMRESCO） 1.1g 15 mmol/L KCl（南京化学试剂一厂） 9.325g 250 mmol/L PIPES(0.5mol/L, pH:6.7) 10mL 10 mmol/

1试剂的配制

⑴ 5mol/L的KOH: 10mL

称取KOH（南京化学试剂有限公司）2.8055g 加无菌的Mill-Q水至10mL ⑵ 0.5mol/L的PIPES pH:6.7

称取PIPES固体（进口Sigma）3.775g 加无菌的Mill-Q水至25 mL 用5mol/L的KOH调pH至6.7 并过滤除菌。 ⑶ Inoue转化缓冲液的配制：500mL

试剂 需要量/500mL 终浓度 MnCl2.4H2O（国药集团化学试剂有限公司） 5.44g 55mmol/L CaCl2.2H2O （AMRESCO） 1.1g 15 mmol/L KCl（南京化学试剂一厂） 9.325g 250 mmol/L PIPES(0.5mol/L, pH:6.7) 10mL 10 mmol/

感受态细胞的制备

感受态大肠杆菌制备方法

四川大学生命科学学院

试剂配制：

A液：1M，MnCl2；mol/L

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液：称取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

TB缓冲液：

方法步骤：

1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加

入3.3mlA液，混匀冰浴即可使用。

2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种

于装有100mlSOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，

3、其余与普通感受态差不多，每管加入4mlTB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，

4、加入280mlDMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5mlEP管，冰上静置15分钟。

5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12

小时以上

6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率

一、电转化感受态细胞的制备

1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）

2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。

3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。

5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。

6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。

8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。

9. 次日观察转化子生长情况

感受态细胞的制备：

1.以1:100的比例吸取过夜菌液（250ul）加入25ml LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2-3h至OD600达到0.5左右（OD600范围0.4-0.6）。 2.将25ml菌液移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃。 3.于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

5.每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。 6.于4℃，以4000rpm 离心10min，回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

8.每50ml初始培养物用2ml 用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（含15%甘油）重悬每份细胞沉淀。

9.在冰上将细胞分装成小份，100ul/份，防御-70℃冻存。

10.如果当天要用，最好将制好的感受态细胞在4℃放置4h后再用，效果较好。制备好的感受态细胞在4℃放置24-48h内使用，不影响效果。

感受态细胞制备流程图：

过夜菌 250ul加入 25ml

农杆菌感受态制备

1、划平板，单克隆培养

2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day） 3、50m离心管中4500rpm，15min

4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作 5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存

农杆菌转化

1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min 2．37℃ 热激5min

3. 加1mlLB，28℃培养3-4h

3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干 农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。（GV3101） 庆大霉素 40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平 50mg/ml DMSO溶解 200ml LB + 200ul母液

农杆菌转植物

1. 植物去顶三天后转化，转前一天交足水

2. 摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）

3. 室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中 （200ml/转化） 每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200

感受态细胞的制备

一、 实验原理

受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。

本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。

二、 材料及准备工作 一）材料准备 试剂、耗材名称 蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 琼脂粉 聚乙二醇（PEG8000） DMSO MgCl2 KCl CaCl2 氨苄青霉素 摇菌管 平皿（10cm） 品牌 货号 500ml锥形烧瓶 枪头（1ml，0.2ml） 0.22μm过滤器 50ml注射器 二)试剂配制

1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）

蛋白胨 酵母提取物 氯化钠（NaCl）

2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）

蛋白胨 酵母提取物 氯化钠（NaCl） 琼脂粉

2×1.0g 2×0.5g 2×1.0g 2×1.5g 2.0g 1.0g 2.0g

温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶

感受态细胞的制备方法

1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理 2、感受态细胞不好用的原因 3、影响转化效率的原因 4、为何要低温环境制备

1.感受态

定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。 作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。 优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。

常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.

2.感受态细胞做得不好的原因 一．菌液OD值偏大或偏小 二．原始菌株不好 三．试剂超纯程度不够 四．操作时对菌体伤害过大

3. 影响转化效率的原因

1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）； 2．所有操作均应在无菌条件和

基因工程 转化

实验八

大肠杆菌感受态细胞的 制备与转化

基因工程 转化

实验目的

1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意

义。

2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选 转化体的方法。

基因工程 转化

实验原理

转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引

入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性

状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、

基因工程等研究的基本实验技术。

基因工程 转化

转化中的受体细胞

转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰

系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲

基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。

基因工程 转化

实验原理

转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学 试剂法 感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发 生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时 细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的 受体细胞( Transformant )。

基因工程 转化

实验原理

本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携 带有抗氨苄青霉素的基因，因而使

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养1