sds蛋白电泳原理

SDS-PAGE

一. 实验原理

SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材

30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃ 贮存，每

实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳 蛋白质电泳 准备实验----------溶液的配置 溶液的配置

实验内容

一、变性蛋白质电泳系列溶液1、单体母液 (1,4,8组) 、 50 ml 组 15.00 g 丙烯酰胺 0.40 g 甲叉双丙烯酰胺 去离子水定容至50 ml ,定性中速滤纸过滤，棕 去离子水定容至 定性中速滤纸过滤， 定性中速滤纸过滤 色试剂 瓶4℃存放。 ℃存放。 2、 10% (w/v) SDS (2,4,9组) 10ml 、 % 组 SDS 1.0 g 10 ml 去离子水

3、分离胶缓冲液(4×,pH=8.80,50 ml)( 、分离胶缓冲液( × )(1,7,8组) , )( 组 Tris-Base(1.5 mol/L) 9.08 g 10%(w/v)SDS 2 ml % 用30ml去离子水溶解，再用浓HCl调节 到8.8,过 去离子水溶解，再用浓 调节pH到 ， 去离子水溶解 调节 定容到50ml,4℃存放。 滤，定容到 ℃存放。 4、浓缩胶缓冲液(4× ,pH=6.80,50 ml )( 、浓缩胶缓冲液( × )(3,5,10组) , 组 Tris-Base(0.50 mol/L) 3

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、实验目的

学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、实验目的

学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶

双向电泳

一、材料

样品：人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH

二、试剂

SDS-PAGE所需试剂 1、30％Acry-Bis (w/v)

29.2％Acry29.2g

0.8％Bis0.8g

加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，PH<7，数月后重配

2、10％的SDS贮液 (w/v)

RT保存，因SDS在4℃会析出

3、Tris-HCl buffer

①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer

100ml含Tris18.171g，加DDW至80ml，用浓HCl调PH8.8，再定容至100ml，4℃保存

②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer：

50ml 含Tris6.057g，加DDW至40ml，用浓HCl调PH6.8，再定容至50ml，4℃保存

4、TEMED

以游离碱形式发挥作用，催化AP形成自由基，故PH较低时，聚合反应受抑制，易吸湿，被氧化，从无色变为黄色，故因密闭4℃保存

5、10％ AP

1g的AP溶于10ml水中，4℃保存，隔周新鲜配置

6、PH8.3 电泳缓冲液1L，RT保存

Tris碱

Gly（25.05） SDS

加水至1L，可不调PH

7、甘油液4℃

蛋白质双向电泳实验流程

一．样品制备 1.研磨

研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。

2.加入8mLTris饱和酚（pH8.8）和8mL抽提液，在通风橱内研磨30s。 先加8mLTris饱和酚，Tris饱和酚会变成固体，此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。接着加入8mL抽提液，也需将固体的抽提液研磨成小块。等三者混匀后，将粉末转移至45 mL tube。

3.振荡30min。

室温静置，待tube中固体变成液体后，开始振荡。振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。

4.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45mL tube。酚相（top phase）可置于冰上。

酚相应该是绿色的，水相应该是淡黄色的。

5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。 振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。

6.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45mL tube。

7.沉淀酚相。取一定体积（是酚相的5倍）的0.1M乙酸铵/甲醇溶液（–20℃保存）于酚相（45mL tube）。振荡30s，

使用image j 软件对SDS-PAGE进行灰度分析,定量蛋白质的浓度。

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醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质(山东大学）

Xxxx

20110014xxxx

生科三班 同组者：xxx

一、 实验目的：

掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。

二、 实验原理：

蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带静电荷不同，因此在电场中移动速度不同，故可利用电泳法奖它们分离。

血清中含有白蛋白、α-球蛋白，β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同（见表1），在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH7.0，所以在缓冲液（pH8.6）中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。

表1 人血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量

蛋白质名称

白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 三、 实验器材：

醋酸纤维薄膜（2㎝×8㎝，厚度120μm）、人血清（新鲜、无溶血现象）、培养皿Φ10㎝（×5）、点样器（或玻璃片）、镊子、玻璃棒、电吹风、吸管5.0㎝（×1

CTAB法提取DNA的原理及步骤：

冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA，都要加液氮使材料变脆，易于研磨。低温降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来。

CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，从而去除CTAB 。

1.研磨

2.加1000ul预处理液，10-15min，4000r，10min,弃上清（重复） 预处理液：Tris-hcl (PH8.0) 提供缓冲环境，防止核酸被破坏。 EDTA （螯合二价阳离子）0.5M 抑制DNase活性。 Nacl 5M 提供高盐环境，使DNA充分溶解。 β-巯基乙醇 抗氧化剂，去除酚，糖，能与酚形成

CTAB法提取DNA的原理及步骤：

冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA，都要加液氮使材料变脆，易于研磨。低温降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来。

CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，从而去除CTAB 。

1.研磨

2.加1000ul预处理液，10-15min，4000r，10min,弃上清（重复） 预处理液：Tris-hcl (PH8.0) 提供缓冲环境，防止核酸被破坏。 EDTA （螯合二价阳离子）0.5M 抑制DNase活性。 Nacl 5M 提供高盐环境，使DNA充分溶解。 β-巯基乙醇 抗氧化剂，去除酚，糖，能与酚形成