pcr实验材料与方法

1 材料与方法 1.1实验材料

1.2实验方法

1.2.1 MjCBP RNA水平组织分布和表达模式 1.2.2 MjCBP的克隆，重组表达载体的构建 1.2.3 MjCBP蛋白的重组表达、纯化 （1.2.4 MjCBP多克隆抗体制备）

（1.2.5 MjCBP蛋白水平组织分布、表达模式） 1.2.6 干扰后弧菌清除实验，过表达后弧菌清除实验

2 实验结果 2.1 进化树

2.2 组织分布和表达模式 2.3 纯化

2.4 弧菌刺激 血、肠 进化树

使用ClustalW1.8 软件, 将剑尾鱼P-gp 推断的氨基酸序列与GenBank 中登录的其他动物P-gp 进行多序列比对, 采用MEGA4.0 软件包进行构建系统树。

用NCBI BALST(http：//blast．ncbi．nlm．nih．gov／blast．cgi)、ExPASy_ProtParam(http：／／web．expasy．org／protpa—ram／)、PredictProtein(http：／／www．predictprotein．org／)、SignalP 4．1 Server(http：／／www．cbs．dtu．dk／cgi—bin／1和NCBI CD

第1章 实验材料与方法

1.1 实验材料与设备

1.1.1 实验材料

本实验采用的材料有：碳纤维（3 K，大连新科碳纤维有限公司）；羟基磷灰石粉末（60 nm，南京埃普纳米材料有限公司）；有机单体丙烯酰胺（AM，分析纯，日本Mitsui Toatsu化学公司生产）；交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBAM，化学纯，北京红星生物化学制品厂）；分散剂六偏磷酸钠（分析纯，北京化学试剂公司）；引发剂过硫酸铵（(NH4)2S2O4，分析纯，北京化学试剂三厂）；催化剂N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED，化学纯，北京兴福精细化学研究所）；氨水（化学纯，天津永晟精细化工有限公司）；无水乙醇（CH3CH2OH，天津永晟精细化工有限公司）；五氧化二磷（P2O5，天津市盛淼精细化工有限公司）；硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O，天津永晟精细化工有限公司）。

1.1.2 实验设备

所用实验设备如表2-1所示。

表2-1 实验设备

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

设备名称 球磨机 旋转粘度计 水浴炉 电热恒温鼓风干燥箱

离心机 箱式电阻炉 真空管式炉 扫描电镜 显微硬度计 电子万能试验机

型号 C062-7 NDJ-1 DZKW-4 DL

RT-PCR原理与实验技术

一、知识背景：

1、基因表达：DNA RNA Protein

单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白） 共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：

A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。

＋

3、逆转录酶和RT-PCR

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：

1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链

临床PCR实验攻略

? 基础篇

一、如何选择试剂，评价试剂是否符合自己实验室条件？

现在临床PCR实验室使用的试剂大部分都是各生产企业提供的商品化的试剂盒，那么试剂质量的好坏直接决定了实验结果的好坏，而不同厂家试剂的性能、质量和价格千差万别，如何选择一款合适的试剂对每个PCR实验室都至关重要，一般来说，选择试剂主要从以下几个方面进行评价： 1、重复性

首先，试剂检测结果的重复性直接展现了试剂的方法学及其质量的好坏，是评价试剂好坏最明显、最直接的指标。

其次，我们在此说的试剂重复性是指对原始样本检测的重复性，而不是对某一个样本提取的核酸进行重复性的检测和评价。

最后，试剂的重复性对于疗效检测、用药指导有着重大的意义，一个重复性好的试剂，往往能够在病人的抗病毒治疗过程中，给医生和病人提供最直接、最可靠的数据，让医生和病人对疾病进展有更清楚的认识，从而制定合理的治疗方案，实现更好的治疗效果。 2、灵敏度

一个试剂的灵敏度往往能够体现该试剂的技术水平和先进程度，同时对于临床病症的监测有着举足轻重的意义。以乙肝为例来说，我国的乙肝复发率远远大于发达国家，同时由乙肝病毒感染转换为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列，这很大程度上与对低载量病毒监控的严

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得

PCA与PLS仿真报告

1.实验目的

1) 了解PCA和PLS的基本原理。

2) 利用Matlab程序语言建立真实线性和非线性数学模型，并利用PCR和PLS预估

该模型，并计算对应的校正标准误差（SEC）、交叉检验标准误差（SECV）和预测标准误差（SEP），判断预估模型的准确性。

3) 分析噪声大小和样本矩阵线性关联对模型稳健性的影响。

2.算法介绍

2.1 主成分分析（Principal Component Regression）

主成分回归法（PCR）是采用多元统计中的主成分分析方法（Principal Component Analysis），先对输入矩阵X进行分解，然后选取其中的主成分来进行多元线性回归分析，故称之为主成分回归。

2.1.1主成分分析原理

PCA将矩阵X（n×k）分解为k个向量的外积之和，即：

TTT （2-1） X?t1p1?t2p2???tkpk式中t为得分向量（Score Vector）；p为载荷向量（Loading Vector）或称为主成分。上式也可写成下列矩阵形式：

X?TPT （2-2）

式中T??t1,t2,?,tn?称

PCA与PLS仿真报告

1.实验目的

1) 了解PCA和PLS的基本原理。

2) 利用Matlab程序语言建立真实线性和非线性数学模型，并利用PCR和PLS预估

该模型，并计算对应的校正标准误差（SEC）、交叉检验标准误差（SECV）和预测标准误差（SEP），判断预估模型的准确性。

3) 分析噪声大小和样本矩阵线性关联对模型稳健性的影响。

2.算法介绍

2.1 主成分分析（Principal Component Regression）

主成分回归法（PCR）是采用多元统计中的主成分分析方法（Principal Component Analysis），先对输入矩阵X进行分解，然后选取其中的主成分来进行多元线性回归分析，故称之为主成分回归。

2.1.1主成分分析原理

PCA将矩阵X（n×k）分解为k个向量的外积之和，即：

TTT （2-1） X?t1p1?t2p2???tkpk式中t为得分向量（Score Vector）；p为载荷向量（Loading Vector）或称为主成分。上式也可写成下列矩阵形式：

X?TPT （2-2）

式中T??t1,t2,?,tn?称

PCA与PLS仿真报告

1.实验目的

1) 了解PCA和PLS的基本原理。

2) 利用Matlab程序语言建立真实线性和非线性数学模型，并利用PCR和PLS预估

该模型，并计算对应的校正标准误差（SEC）、交叉检验标准误差（SECV）和预测标准误差（SEP），判断预估模型的准确性。

3) 分析噪声大小和样本矩阵线性关联对模型稳健性的影响。

2.算法介绍

2.1 主成分分析（Principal Component Regression）

主成分回归法（PCR）是采用多元统计中的主成分分析方法（Principal Component Analysis），先对输入矩阵X进行分解，然后选取其中的主成分来进行多元线性回归分析，故称之为主成分回归。

2.1.1主成分分析原理

PCA将矩阵X（n×k）分解为k个向量的外积之和，即：

TTT （2-1） X?t1p1?t2p2???tkpk式中t为得分向量（Score Vector）；p为载荷向量（Loading Vector）或称为主成分。上式也可写成下列矩阵形式：

X?TPT （2-2）

式中T??t1,t2,?,tn?称

RT-PCR

注意：酶现拿现用，用完放回—20度

先配后加，节约枪头

试剂用前弹一下，再甩一下，再用；每次加液也是如此

一、DNase处理：

1、10ul 体系

Total RNA 1ug（或者2ug）A ul

10*buffer （含Mgcl2 ）1ul

DNase（1U/ul）1ul

DEPC free water补足总体积10ul即为8-A ul

总体积：10ul

37℃，30分钟即DnaseⅠ

2、加入25mM的EDTA（终止DNA酶活性）1ul，（可以不加，无太大影响）

65℃，10min，即DnaseⅡ

备注：这一步后，共有11 ul的产物，取10ul进行一下的步骤，留取1ul作为对照，将这个1ul的留样用1ul的水稀释。

二、逆转录

（以下为20ul的体系，如果样品过多，或者不同体系可以等比加样）

1、加入，并混匀

1)总RNA（含有1-2ugRNA，或者是10ul的第一步中经过DNase处理的总RNA）

10ul

2)Primer oligo（dt）18 （0.5ug/uL）1ul

3)dNTP（10mM）1ul

总体积：12ul 65℃，5min，立即取出放置在冰上（保持开链状态）即程序cDNAⅠ

2、加入，并混匀

5 x first brand buffer 4ul

0.

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pcr扩增实验报告

篇一：DNA提取及PCR扩增实验报告

PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳 1131428 环境科学 一、实验目的

1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。

2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。 二、实验原理 1. PCR扩增

多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）----------------精选公文范文----------------

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---------------------------------精选公文范文--------------------------

与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在T