蛋白sds page电泳实验报告
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SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE
一. 实验原理
SDS 是一种阴离子表面活性剂,在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后,巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原, SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下,SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电,使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形的长椭圆棒,不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样,约为 1.8nm ,而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因,蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只与椭圆棒的长度有关, 也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材
30%凝胶贮液(100mL):称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中,向烧杯中加入约60mL双蒸水,充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL,置于棕色瓶内4℃ 贮存,每
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶
05实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳准备实验
实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳 蛋白质电泳 准备实验----------溶液的配置 溶液的配置
实验内容
一、变性蛋白质电泳系列溶液1、单体母液 (1,4,8组) 、 50 ml 组 15.00 g 丙烯酰胺 0.40 g 甲叉双丙烯酰胺 去离子水定容至50 ml ,定性中速滤纸过滤,棕 去离子水定容至 定性中速滤纸过滤, 定性中速滤纸过滤 色试剂 瓶4℃存放。 ℃存放。 2、 10% (w/v) SDS (2,4,9组) 10ml 、 % 组 SDS 1.0 g 10 ml 去离子水
3、分离胶缓冲液(4×,pH=8.80,50 ml)( 、分离胶缓冲液( × )(1,7,8组) , )( 组 Tris-Base(1.5 mol/L) 9.08 g 10%(w/v)SDS 2 ml % 用30ml去离子水溶解,再用浓HCl调节 到8.8,过 去离子水溶解,再用浓 调节pH到 , 去离子水溶解 调节 定容到50ml,4℃存放。 滤,定容到 ℃存放。 4、浓缩胶缓冲液(4× ,pH=6.80,50 ml )( 、浓缩胶缓冲液( × )(3,5,10组) , 组 Tris-Base(0.50 mol/L) 3
IEF-SDS PAGE双向电泳技术
双向电泳
一、材料
样品:人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH
二、试剂
SDS-PAGE所需试剂 1、30%Acry-Bis (w/v)
29.2%Acry29.2g
0.8%Bis0.8g
加水至100ml溶解,棕色试剂瓶4℃贮存,PH<7,数月后重配
2、10%的SDS贮液 (w/v)
RT保存,因SDS在4℃会析出
3、Tris-HCl buffer
①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer
100ml含Tris18.171g,加DDW至80ml,用浓HCl调PH8.8,再定容至100ml,4℃保存
②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer:
50ml 含Tris6.057g,加DDW至40ml,用浓HCl调PH6.8,再定容至50ml,4℃保存
4、TEMED
以游离碱形式发挥作用,催化AP形成自由基,故PH较低时,聚合反应受抑制,易吸湿,被氧化,从无色变为黄色,故因密闭4℃保存
5、10% AP
1g的AP溶于10ml水中,4℃保存,隔周新鲜配置
6、PH8.3 电泳缓冲液1L,RT保存
Tris碱
Gly(25.05) SDS
加水至1L,可不调PH
7、甘油液4℃
实验六SDS-PAGE
实验三 SDS-PAGE
【目的要求】
1.了解并掌握SDS-PAGE 电泳原理及方法。 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 【实验原理】
十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋白质,并可测定蛋白质的相对分子量,其原理主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关。
1 凝胶的分子筛效应:聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶,蛋白质颗粒在电场中通过此凝胶时会受到阻碍。大分子蛋白质受到的阻力大,电泳速度小,而小分子蛋白质受到的阻力小,移动快,因而最终在凝胶中得以分离。 2 电荷效应:SDS 是一种表面活性剂,在蛋白样品和凝胶中加入SDS,则能与蛋白质分子上的疏水基团结合,使蛋白质表面覆盖一层SDS 分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷,且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量,因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差别,使各种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷,分子之间的电荷差异消失。
3 变性效应:SDS 同时还破坏了蛋白质中的非共价键。导致蛋白质
变性,使SDS-蛋白质复合物在溶液中呈现相似的形状。因此蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状
image j对SDS-PAGE灰度分析定量蛋白浓度
使用image j 软件对SDS-PAGE进行灰度分析,定量蛋白质的浓度。
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凝胶电泳实验报告模板
重庆大学研究生专业实验教学
实验报告书
实验课程名称: 实验指导教师: 学 院: 专业及类别: 学 号: 姓 名: 实验日期: 成 绩:
凝胶电泳实验
生物学
重庆大学研究生院制
一、实验目的
1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。
3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。
4.利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的DNA片段。
5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂
1.材料:菌落PCR产物(待检测DNA片段);
2.用具:①琼脂糖凝胶电泳:电泳仪,水平板型电泳槽,电子天平,微量移液器
(10μl),枪头,三角瓶,点样板,梳子,微波炉,凝胶成像仪;
②聚丙烯酰胺凝胶电泳:垂直板电泳槽,稳压稳流电泳仪,梳子;
3.试剂:琼脂糖,1×TAE缓冲液,载样缓冲液(Loading buffer),goldviwe染料,
DL5,000 DNA Marker (Takara)。
三、实验原理
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一,用于分离、鉴
SDS-PAGE常见问题
蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散?
回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律,这种情况常发生在高浓度胶或凝固不 一致的胶里,你可以加大阴极的缓冲液浓度,可能会有点改善
胶凝的快慢不在于TEMED多少,在于APS的量,APS提供自由基,TEMED帮助自由基作用, 是催化剂,对凝固速度影响不是太大,可以试试加大APS的量
丙烯酰胺在凝胶中的百分比 分离胶的分辨范围 15 % 15~45 kDa 12.5% 15~60 kDa 10 % 18~75 kDa 7.5% 30~120kDa 5 % 60~212kDa 来源于《蛋白质技术手册》汪家政
每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质,而是指在这个区
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重庆大学研究生专业实验教学
实验报告书
实验课程名称: 实验指导教师: 学 院: 专业及类别: 学 号: 姓 名: 实验日期: 成 绩:
凝胶电泳实验
生物学
重庆大学研究生院制
一、实验目的
1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。
3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。
4.利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的DNA片段。
5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂
1.材料:菌落PCR产物(待检测DNA片段);
2.用具:①琼脂糖凝胶电泳:电泳仪,水平板型电泳槽,电子天平,微量移液器
(10μl),枪头,三角瓶,点样板,梳子,微波炉,凝胶成像仪;
②聚丙烯酰胺凝胶电泳:垂直板电泳槽,稳压稳流电泳仪,梳子;
3.试剂:琼脂糖,1×TAE缓冲液,载样缓冲液(Loading buffer),goldviwe染料,
DL5,000 DNA Marker (Takara)。
三、实验原理
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一,用于分离、鉴