sds—page蛋白质电泳实验报告

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05实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳准备实验

标签:文库时间:2025-02-13
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实验五 SDS-PAGE蛋白质电泳 蛋白质电泳 准备实验----------溶液的配置 溶液的配置

实验内容

一、变性蛋白质电泳系列溶液1、单体母液 (1,4,8组) 、 50 ml 组 15.00 g 丙烯酰胺 0.40 g 甲叉双丙烯酰胺 去离子水定容至50 ml ,定性中速滤纸过滤,棕 去离子水定容至 定性中速滤纸过滤, 定性中速滤纸过滤 色试剂 瓶4℃存放。 ℃存放。 2、 10% (w/v) SDS (2,4,9组) 10ml 、 % 组 SDS 1.0 g 10 ml 去离子水

3、分离胶缓冲液(4×,pH=8.80,50 ml)( 、分离胶缓冲液( × )(1,7,8组) , )( 组 Tris-Base(1.5 mol/L) 9.08 g 10%(w/v)SDS 2 ml % 用30ml去离子水溶解,再用浓HCl调节 到8.8,过 去离子水溶解,再用浓 调节pH到 , 去离子水溶解 调节 定容到50ml,4℃存放。 滤,定容到 ℃存放。 4、浓缩胶缓冲液(4× ,pH=6.80,50 ml )( 、浓缩胶缓冲液( × )(3,5,10组) , 组 Tris-Base(0.50 mol/L) 3

SDS-PAGE蛋白电泳方法

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SDS-PAGE

一. 实验原理

SDS 是一种阴离子表面活性剂,在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后,巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原, SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下,SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电,使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形的长椭圆棒,不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样,约为 1.8nm ,而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因,蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只与椭圆棒的长度有关, 也就是蛋白质 Mr 的函数。 二. 试剂器材

30%凝胶贮液(100mL):称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中,向烧杯中加入约60mL双蒸水,充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL,置于棕色瓶内4℃ 贮存,每

SDS-PAGE电泳实验步骤

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垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、实验目的

学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶

SDS-PAGE电泳实验步骤

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垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、实验目的

学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶

蛋白质双向电泳实验流程

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蛋白质双向电泳实验流程

一.样品制备 1.研磨

研磨时间要尽量短,并需及时补充液氮,研磨要充分,同时要保证损失少。

2.加入8mLTris饱和酚(pH8.8)和8mL抽提液,在通风橱内研磨30s。 先加8mLTris饱和酚,Tris饱和酚会变成固体,此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。接着加入8mL抽提液,也需将固体的抽提液研磨成小块。等三者混匀后,将粉末转移至45 mL tube。

3.振荡30min。

室温静置,待tube中固体变成液体后,开始振荡。振荡需持续30min,每振荡1min,置于冰上冷却1min。

4.10000g,4℃,10min。将酚相(top phase)转移至45mL tube。酚相(top phase)可置于冰上。

酚相应该是绿色的,水相应该是淡黄色的。

5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相,蜗旋振荡30min。 振荡需持续30min,每振荡1min,置于冰上冷却1min。

6.10000g,4℃,10min。将酚相(top phase)转移至45mL tube。

7.沉淀酚相。取一定体积(是酚相的5倍)的0.1M乙酸铵/甲醇溶液(–20℃保存)于酚相(45mL tube)。振荡30s,

蛋白质

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班级:________________ 姓名:________________ 学号:________________ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _装_ _ _ _ _订_ _ _ _ _线_ _ _(装订线内禁止填写答案)_ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____

一、单项选择题,(在备选答案中只有一个是正确的)(本大题共100小题,100分)

1. 维系蛋白质α-螺旋和β-折叠结构稳定的化学键是

A.氢键 B.离子键 C.二硫键 D.疏水作用 E.肽键

(4)氨基酸的疏水侧链很少埋在蛋白质分子的内部 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

11. 在电场中,蛋白质泳动速度取决于

A.蛋白质颗粒的大小 B.蛋白质颗粒的形状 C.带净电荷的多少

D.A+C

E.蛋白质所带电荷的多少,分子量的大小

IEF-SDS PAGE双向电泳技术

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双向电泳

一、材料

样品:人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH

二、试剂

SDS-PAGE所需试剂 1、30%Acry-Bis (w/v)

29.2%Acry29.2g

0.8%Bis0.8g

加水至100ml溶解,棕色试剂瓶4℃贮存,PH<7,数月后重配

2、10%的SDS贮液 (w/v)

RT保存,因SDS在4℃会析出

3、Tris-HCl buffer

①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer

100ml含Tris18.171g,加DDW至80ml,用浓HCl调PH8.8,再定容至100ml,4℃保存

②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer:

50ml 含Tris6.057g,加DDW至40ml,用浓HCl调PH6.8,再定容至50ml,4℃保存

4、TEMED

以游离碱形式发挥作用,催化AP形成自由基,故PH较低时,聚合反应受抑制,易吸湿,被氧化,从无色变为黄色,故因密闭4℃保存

5、10% AP

1g的AP溶于10ml水中,4℃保存,隔周新鲜配置

6、PH8.3 电泳缓冲液1L,RT保存

Tris碱

Gly(25.05) SDS

加水至1L,可不调PH

7、甘油液4℃

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

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检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用

① FRET技术(in vivo)

FRET,Fluorescence resonance energy transfer,即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后,它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白,使其释放另一波长的荧光,如下图所示:

以下图为例,若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用,需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合,并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发,并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光,那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用;反之,则是这两种蛋白没有相互作用。

②酵母双、三杂交技术(in vivo)

酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用,其原理是典型的真核生长转录因子,如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域,即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此,设计不同的两个载体,一个含有AD基因(假设为A载体),另一个含有BD基因(假设为B载体)。

一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上,作为诱饵(Bait),将未知蛋白的基因连在A载体上,将这两

蛋白质沉淀反应实验

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蛋白质的沉淀反应

一、目的和要求

1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2、掌握几种沉淀蛋白质的方法 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系 二、沉淀反应 (一)原理

在水溶液中,蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用,所以成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定的状态是有条件的。在某些理化因素的作用下,蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性,则会以固态形式从溶液中析出,这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型:

1、可逆沉淀反应

沉淀反应发生后,蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显著变化。在沉淀因素去除后,又可恢复其亲水性,这种沉淀反应就是可逆沉淀反应,也叫做不变性沉淀反应。属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。

2、不可逆沉淀反应

蛋白质在沉淀的同时,其空间结构发生大的改变,许多副键发生断裂,即使除去沉淀因素,蛋白质也不会恢复其亲水性,并丧失生物活性,这种沉淀反应就是不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

(二)盐析 1、材料与试剂

(1)10%的卵清蛋白溶液(要求新鲜配制)、浓蛋白溶液(2)饱和硫酸铵

蛋白质

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第五章 蛋白质(Protein) 本章主要内容(Content)

蛋白质的一般性质(General aspects)

■ 结构 ■ 蛋白质-水相互作用,影响蛋白质水溶性的因素 ■ 蛋白质-脂的相互作用 蛋白质的变性(Denaturation)

■ 蛋白质变性产生的效应 ■ 导致蛋白质变性的物理因素 ■ 导致蛋白质变性的化学因素

蛋白质的功能性质(Functional Properties) 定义与分类

水化性质 溶解度与粘度、凝胶作用

组织化 热凝结和形成、纤维的形成热塑挤压、面团 乳化性质 乳化能力与乳化稳定性 起泡作用 起泡性与泡沫稳定性 ?蛋白质的营养特性(Nutritional properties) ?蛋白质的开发利用(Utilization)

植物蛋白质和动物蛋白质:浓缩蛋白质与分离蛋白质利用微生物生产蛋白质——单细胞蛋白 第一节 引言(Introducti

■ 蛋白质是构成生物体的基本物质。

病毒,细菌,激素,植物和动物细胞原生 质都是以蛋白质为基

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础的。

■ 酶是蛋白质 已经发现数以千计的酶。 ■ 蛋白质是由20种氨基酸构成的聚合物 一、蛋白质的分类: (一)根据组成分类

? 简单蛋白质(