质粒DNA的小量制备中buffer PW作用

实验一 质粒DNA的小量制备

（碱裂解法）

一、

实验原理

所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：

①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。

本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是：加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。

环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），

实验一 质粒DNA的小量制备

（碱裂解法）

一、

实验原理

所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：

①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。

本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是：加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。

环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），

实验一 质粒DNA的微量制备（4学时）

实验目的

(1) 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 (2) 掌握碱裂解法分离、纯化质粒DNA的方法。

实验原理

质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。目前，质粒已广泛的用作基因工程中目的基因地运载工具—载体。从大肠杆菌中提取质粒DNA，是一种分子生物学最基本的方法。

质粒DNA分离纯化方法有多种，但其原理和步骤都大同小异。本实验着重介绍碱裂解法制备微量DNA。

在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有

质粒DNA的提取、纯化与纯度鉴定

李笃财 生科

1班 201200140048

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理。 【实验原理】

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离

实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化

一、实验目的

学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。

二、实验原理

在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。

三、实验材料

大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）

四、实验仪器、用具

高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪

五、实验试剂

LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖 抽提质粒DNA所需的溶液：

山东大学实验报告

姓名 宿智新 学院 生命科学学院 班级 11级生工2班 科目 分子生物学实验 学号 201100140155 第 8 组

质粒DNA的提取、纯化与鉴定

摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5?（E.coli DH5?）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。 关键词：碱变法 质粒 电泳 实验目的：

1. 学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2. 学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3. 学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4. 掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5. 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 实验原理：

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度

质粒DNA的提取、纯化及验证

一、实验目的

1、掌握碱变性提取法质粒DNA的原理、方法及各种试剂的使用 2、掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理和方法。 二、实验材料、试剂及器具 1、材料

E.coliDH 5α（pUC 19 vector） 2、试剂

1)LB培养基 2)TE缓冲液 3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ 4)无水乙醇 5)70%乙醇 6）苯酚、氯仿 7)氨苄青霉素 3、器具

离心机、离心管、枪尖、移液枪 三、实验步骤 1、质粒提取

取LB平板上E.coliDH 5α（pUC 19 vector）→接种到LB+AP(20ml)培养基37℃,过夜培养→第二天早晨转接到LB+AP(50ml)培养基中，37℃，4-6h→称离心管空管重量W1，取约40ml菌液（装到离管上缘1cm处）→7000rpm离心5min→弃上清，加5ml溶液Ⅰ,涡旋打散菌泥洗涤再离心（7000rpm,5min）→弃上清，干燥，称重W2→每100ml菌泥加入溶液Ⅰ1ml,涡旋，冰浴5min→按量加入溶液Ⅱ2ml,轻加轻摇，冰浴5min→按量加入溶液Ⅲ1.5ml,轻加轻摇，冰浴10min→12000rpm,15min→转上清液至新管，加1/10V 3mol/

综述：质粒DNA 生产工艺的研究进展

一、质粒DNA

细菌质粒（plasmid ）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid ）是一种RNA 质粒之外，迄今所知的所有质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA 分子[1] ，质粒DNA 分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代[2] ，为了更好地适应细胞的生理特点，质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中[3] 。环形双链的质粒DNA 分子具有三种不同的构型：超螺旋型（SC）质粒DNA ;开环型（0C）质粒DNA和线性（L）质粒DNA 分子[4] 。用于基因工程改造的质粒载体通常包括复制子、选择标记和目的基因和启动子[5] ，为了获得高稳定性、高产量的质粒DNA ，在构建质粒DNA 时，需仔细从以下几个方面着手考虑。

1. 质粒复制子的选择

Prazeres[6] 报道到2010 年，以质粒为核心的基因免疫和治疗的市场产值将会超过450 亿美元，质粒DNA 的需求不断加大。因此，无论从科学还是经济角度出发，在构建DNA 疫苗和基因治疗用途的质粒时，为了提高质粒产量，复制子的选择非常

综述： 质粒DNA生产工艺的研究进展

一、质粒DNA

细菌质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的

遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA质粒之外，迄今所知的所有质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA分子[1]，质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代[2]，为了更好地适应细胞的生理特点，质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中[3]。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：超螺旋型（SC）质粒DNA；开环型（OC）质粒DNA和线性（L）质粒DNA分子[4]。

用于基因工程改造的质粒载体通常包括复制子、选择标记和目的基因和启动子[5]，为了获得高稳定性、高产量的质粒DNA，在构建质粒DNA时，需仔细从以下几个方面着手考虑。 1. 质粒复制子的选择

Prazeres[6]报道到2010年，以质粒为核心的基因免疫和治疗的市场产值将会超过450亿美元，质粒DNA的需求不断加大。因此，无论从科学还是经济角度出发，在构建DNA疫苗和基因治疗用途的质粒时，为了提高质粒产量，复制子的选择非常关键，目前，绝大多数学者选

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1.PCR(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DN