酵母rna的提取实验报告稀碱法

酵母RNA的提取紫外吸收法测RNA浓度实验报告

一、实验目的

1、掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。

2、掌握紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。 3、熟悉紫外分光光度计的使用方法。 二、实验原理

核酸是生命的最基本物质之一，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。对核酸的研究是更深入研究生命体的基本前提之一。研究核酸需要纯度很高的核酸，所以核酸的提取方法也就在生物学研究中相当重要。本次实验提取酵母的核糖核酸（RNA）。RNA离体后稳定性很差，含量低，所以在提取的时候就要注意防止核酸的降解和变性，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止RNA酶的作用。本实验是医药卫生领域与大工业生产的基础方法。

核酸（RNA）都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的，故测定组成核苷酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量。 提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。使用浓盐法提取RNA的时候应该注意掌握温度，直接至90~100℃浸提，

实验报告

实验三 酵母RNA的提取及含量测定

一、实验目的与要求

1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。

2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，

3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

二、实验原理

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一

生物化学实验报告

实验三酵母核糖核酸的提取及测定

一、研究背景及目的

RNA（核糖核酸）属酸性高分子化合物，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，参与蛋白质生物合成、调控基因表达、作为核酶催化生化反应活性等，对维持生物体的正常发育有着重要作用。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。核糖核苷酸与其衍生物作为一大类RNA制剂，在生物体内有着诸多的功能，例如：ATP是细胞内的能量通用货币，cAMP作为第二信使传递胞外信号，CoⅠ、CoⅡ、CoA、FAD作为酶的辅因子在催化反应中起重要作用，UDP等作为单糖载体在糖代谢中起着重要作用等。此外，鸟苷酸（GMP）和肌苷酸（IMP）是强力助鲜剂，胞苷酸（CMP）和尿苷酸（UMP）可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料；在化妆品中加入核酸或其水解物，可促进皮肤蛋白合成，达到养护皮肤的作用；在农业上，RNA降解物具有促进作物生长增产的作用，因此RNA制剂被广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等各产业，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴

生物化学实验报告

实验三酵母核糖核酸的提取及测定

一、研究背景及目的

RNA（核糖核酸）属酸性高分子化合物，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，参与蛋白质生物合成、调控基因表达、作为核酶催化生化反应活性等，对维持生物体的正常发育有着重要作用。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。核糖核苷酸与其衍生物作为一大类RNA制剂，在生物体内有着诸多的功能，例如：ATP是细胞内的能量通用货币，cAMP作为第二信使传递胞外信号，CoⅠ、CoⅡ、CoA、FAD作为酶的辅因子在催化反应中起重要作用，UDP等作为单糖载体在糖代谢中起着重要作用等。此外，鸟苷酸（GMP）和肌苷酸（IMP）是强力助鲜剂，胞苷酸（CMP）和尿苷酸（UMP）可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料；在化妆品中加入核酸或其水解物，可促进皮肤蛋白合成，达到养护皮肤的作用；在农业上，RNA降解物具有促进作物生长增产的作用，因此RNA制剂被广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等各产业，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴

总RNA提取（TRIzol法）

仪器和材料：氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（1000μL，200μL，

10μL）、移液枪、无RNA酶EP管（有1.5mL、2mL、15mL、50mL等不同规格）、75%乙醇（尽量现配现用，配制好后置于4℃冰箱待用）、滤纸、DEPC水、计时器记号笔等

注：上述材料标记好提RNA专用，自己保管好！

操作步骤：

1．细胞悬液按照每5×105~106个细胞加1mL TRIzol，贴壁细胞直接加TRIzol裂解，（1个T25cm2细胞培养瓶可加1~2mL TRIzol，可根据需求来添加），裂解数分钟（5~10分钟，可在倒置显微镜下观察细胞脱落情况），反复用枪吹打或持续振荡以裂解细胞。

2．将上述TRIzol裂解液转移至1.5mL EP管中，每个EP管做好标记，按照每1mL TRIzol加200μL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力振荡（手动）15秒，在室温下放置10~15分钟（观察到明显分层即可）；然后4℃离心机12000rpm离心15分钟。

3．将离心后EP管内上层液体转入新的EP管内（离心后分为3层，注意吸取第一层水相时不要吸到第二层，一般可吸到500μL左右），按照每1mL TRIzol加500μL异丙

总RNA的提

实验九 总RNA的提取、定量与RT-PCR

一、总RNA的提取与定量

目的：

从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5 g RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离

。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是

生物化学实验预习报告

实验三酵母核糖核酸的提取及测定

一、研究背景

RNA（核糖核酸）普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，属酸性高分子化合物，参与蛋白质生物合成，调控基因表达，作为核酶催化生化反应活性，对维持生物体的正常发育有着重要作用。此外，由于RNA还具有较强的保湿性、抗氧化性、强烈的紫外光吸收性、天然助长性以及抗皱防衰、防病治癌等特殊功能，[1]人们在研究基础理论的同时逐渐开始对RNA制剂的开发及应用进行探索。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。目前，人们已经开始逐渐接受含RNA制剂的各种产品，需求量日益攀升，RNA制剂已广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等方面，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。但不管是理论研究还是实际应用，都面临一个问题：RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，离体之后稳定性差、含量低，采用廉价、合适的手段分离纯化得到RNA显得至关重要。当然，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法

Trizol法提取总RNA

1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol试剂裂解；

②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；

2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；

3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；

4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；

5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清； 6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）； 7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀； 8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录； 9、进行反转录或分装保存于-80℃

Trizol法提取RNA步骤

1． 胰酶消化六孔板细胞（每孔相当于3.5cm皿），每孔细胞收于EP管中，PBS洗一遍（或

弃旧培养基，1ml PBSA洗2遍，直接向孔中加入600ul Trizol，吹打细胞，并吸入EP管中即可，无需胰酶消化）；

2． 向细胞沉淀中加入600ul Trizol裂解细胞5min；

3． 加入三氯甲烷（氯仿）120ul（V三氯甲烷：VTrizol=1:5）提取核酸； 4． 振荡10s至粉红色出现时停止，室温静置2~3min后分层； 5． 4℃，12000×g，离心15min，离心后，底部为细胞碎片，中间为DNA，上层为RNA产

物；

6． 吸取上层液相RNA提取液，置另一个EP管中（小心勿吸到沉淀，约为250~300ul）； 7． 每管加入异丙醇300ul（V异丙醇：VTRIZOL=1:2）（异丙醇为有机溶剂，根据相似相溶原理，

RNA不溶于其中，其他杂质溶于其中）； 8． 上下颠倒，轻轻混匀，室温下静置10分钟； 9． 4℃，12000×g，离心10分钟，弃上清； 10． 用800ul 75%乙醇（用1‰DEPC处理水配制）洗沉淀，振荡器振荡15秒钟； 11． 4℃，12000×g，离心5分钟，弃上清（挥发乙醇2分钟）

生物化学实验预习报告

实验三酵母核糖核酸的提取及测定

一、研究背景

RNA（核糖核酸）普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，属酸性高分子化合物，参与蛋白质生物合成，调控基因表达，作为核酶催化生化反应活性，对维持生物体的正常发育有着重要作用。此外，由于RNA还具有较强的保湿性、抗氧化性、强烈的紫外光吸收性、天然助长性以及抗皱防衰、防病治癌等特殊功能，[1]人们在研究基础理论的同时逐渐开始对RNA制剂的开发及应用进行探索。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。目前，人们已经开始逐渐接受含RNA制剂的各种产品，需求量日益攀升，RNA制剂已广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等方面，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。但不管是理论研究还是实际应用，都面临一个问题：RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，离体之后稳定性差、含量低，采用廉价、合适的手段分离纯化得到RNA显得至关重要。当然，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法