高效液相色谱柱效能的测定数据处理

实验一 高效液相色谱柱效能的评定

1. 实验目的和要求

1.1了解高效液相色谱仪的基本结构。 1.2初步掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。

1.3 学习高效液相色谱柱效能的评定及分离度的测定方法。

2. 实验原理

苯、甲苯分子非极性部分的总表面积不同，缔合能力不同，其保留时间也不同。通过计算色谱峰的理论塔板数以及各个化学物质间的分离度评价色谱柱的效能。

3. 实验仪器与试剂

3.1 仪器

高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器） 分析天平 3.2 试剂

苯、甲苯（均为分析纯） 甲醇（色谱纯） 高纯水

4. 实验步骤

4.1 色谱条件

色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm 流动相：甲醇-水（80：20，v/v） 流速：1mL·min-1 检测波长：254nm 柱温：30℃ 进样量：20μL 4.2 操作步骤

? 精密配制含苯、甲苯贮备液；

? 分别精密吸取贮备液制备成混合溶液。按照上述色谱条件操作，进样，

1

记录色谱图。

? 计算各色谱峰的理论塔板数及各峰间分离度。 4.3 实验数据处理

? 记录实验条件，测试各试样后记录苯、甲苯的保留时间、峰宽、半峰宽，

计算出各物质对应的理论塔板数。根据保留时间与峰宽信息，计算相邻物质对间的分离

高效液相色谱测定苯萘蒽的含量

一 实验目的

1 熟悉HPLC的结构和操作 2 了解反相高效液相色谱法 3 掌握峰面积归一化法定量方法 二 实验原理 1 仪器结构

储液器→高压泵→进样器→色谱柱→检测器→记录仪 ↓ ↓

梯度洗脱 馏分收集器

2 分离原理

在反相高效液相色谱中其分离原理取决于组分与固定相间作用力的大小差异，组分的非极性相对最强，与固定相作用最强，故保留时间最长，最后被洗脱。

3 归一化法

（1） 定量校正因子：fi’ 即 mi=fi’*Ai

（2） 实验一般用相对定量校正因子：fi fi =As*mi/Ai*ms式中i指样品；

s指标准品，用各组分的标准样品可求出各组分的fi （3） 求各组分含量

Xi=Ai*fi/(A1f1+A2f2+…Anfn)*100%

三 仪器与试剂

1 shimudza高效液相色谱仪，7725i手动进样伐，微量注射器（25μL）,C18柱（250mm×4.6mm,5μm）,超声波脱气机，抽滤器。

2 试剂：甲醇、苯、萘和蒽均为分析纯，水为二次蒸馏水，苯、萘和蒽标准溶液（浓度均为100μg/mL）

高效液相色谱测定苯萘蒽的含量

一 实验目的

1 熟悉HPLC的结构和操作 2 了解反相高效液相色谱法 3 掌握峰面积归一化法定量方法 二 实验原理 1 仪器结构

储液器→高压泵→进样器→色谱柱→检测器→记录仪 ↓ ↓

梯度洗脱 馏分收集器

2 分离原理

在反相高效液相色谱中其分离原理取决于组分与固定相间作用力的大小差异，组分的非极性相对最强，与固定相作用最强，故保留时间最长，最后被洗脱。

3 归一化法

（1） 定量校正因子：fi’ 即 mi=fi’*Ai

（2） 实验一般用相对定量校正因子：fi fi =As*mi/Ai*ms式中i指样品；

s指标准品，用各组分的标准样品可求出各组分的fi （3） 求各组分含量

Xi=Ai*fi/(A1f1+A2f2+…Anfn)*100%

三 仪器与试剂

1 shimudza高效液相色谱仪，7725i手动进样伐，微量注射器（25μL）,C18柱（250mm×4.6mm,5μm）,超声波脱气机，抽滤器。

2 试剂：甲醇、苯、萘和蒽均为分析纯，水为二次蒸馏水，苯、萘和蒽标准溶液（浓度均为100μg/mL）

1、高效液相色谱 仪器设备名称 高效液相色谱仪 数量 1 技术指标四元梯度输液泵：工作模式：相互独立、电子控制的双柱塞直线驱动装 置，双压力传感器反馈回路，无需混合器和阻尼器。溶剂数：1—4。 流速范围：0.010—10.000ml/min, 以 0.001ml/min 为增量。流速精度： ≤0.075%RSD，流速准确度：±1.0%。操作压力：0—5000psi。混合范围： 0.0—100.0% 以 0.1% 增量。梯度曲线：多种梯度曲线，线性、步进、 凸线和凹线。 光电二极管阵列检测器：波长扫描范围：190～800nm。光源：全程氘灯 （190～800nm），不用钨灯。波长准确度：±1nm。测量范围：0.0001～ 2.0000AUFS，可以设定波长范围扫描检测或者定点波长检测。 荧光检测器（2475型）：灯：150W 氙灯，连续弧光。检测限：水的拉 曼光谱 ≥ 1000，激发波长：200—890nm，发射波长：210—900nm， 波长重现性：±0.25nm，波长准确度：±3nm。 色谱软件：原版软件。 仪器组成：四元泵、手动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、荧光检 测器、C18色谱柱、保护柱、原装软件、其它设备运行必须品。

高效液相色谱原理

1、概述

在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。

气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。

2、液相色谱流程图 1、储液罐；2输液泵；3、进样器；4、色谱柱； 5、检测器；6、工作站；7废液灌

3、原理

液相色谱根

一般情况下，HPLC分离方法的建立遵循以下步骤：

(1)了解样品的基本情况

所谓样品的基本情况，主要包括样品所含化合物的数目、种类(官能团)、分子量、pKa 值、UV光谱图以及样品基体的性质(溶剂、填充物等)、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。

(2)明确分离目的

①是分析组分还是制备样品；

②是否已知样品所有成分的化学特性，或是否需做定性分析；

③是否有必要解析出样品的所有成分(比如对映体、非对映体、同系物、痕量杂质)；

④如需做定量分析，精密度需多高；

⑤建立的方法将适用几种样品分析还是许多种样品分析；

⑥将使用最终方法的常规实验室中已有哪些HPLC设备和技术。

(3)了解样品的性质和需要的预处理

除非样品是适于直接进样的溶液，否则，高效液相色谱分离前均需进行某种形式的预处理。有的样品需加入缓冲溶液以调节pH值；有的样品含有干扰物质或“损柱剂”而必须将其去除。此外，为了保证最终的样品溶液与流动相的成分尽量相近，最好用流动相溶解(或稀释)样品。

(4)检测器的选择

不同的分离目的对检测的要求不同，如测单一组分，理想的检测器应仅对所测成分响应，而其他任何成分均不出峰。另外，如果目的是定性分析或是制备色谱，则最好有通用型检测器，以便能检测到混合物中的各种成分

..

高效液相色谱法习题

一、思考题

1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？

7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?

10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？

13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理

14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有

高效液相色谱法习题

一、思考题

1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？

7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?

10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？

13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理

14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同

高效液相色谱在药学中的应用 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代发展起来的一项高效、快速的分离分析技术已被广泛用于各个领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域应用最广、发展最快的现代分析技术之一。有的已被列入药典，成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。 与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细（一般为10μm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。 与气相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；②可选用不同性质的各种溶剂作为流动相，而且流动相对分离的选择性有很大作用，因此分离选择性高；③一般在温室条件下进行分离，不需要高柱温。 高效液相色谱的研究应用进展 药物与人类的健康，生活质量的提高关系极大，许多药

华南师范大学实验报告

学生姓名：杨秀琼 学号： 20082401129 专业： 化 学 年级班级：08化二 课程名称：仪器分析实验 实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯 实验类型：综 合 实验时间：2010/416 实验指导老师 曹立娟老师 实验评分：

一、[实验目的:]

1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法 2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术 二、[实验原理:]

高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。

其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差