重组蛋白纯化三部曲

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

重组蛋白纯化基本策略

捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。 分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。 处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。 在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩G

成长“三部曲”

蓦然回首，发现我们已渐渐长大。不知从什么时候开始。18岁这个字眼已时常挂在嘴角边。曾几何时，认为18岁是那么的神圣，只知道那时，我们长大，可以飞得更高，飞得更远。

每个人小时候都是最幼稚的，经不起风雨，总是无忧无虑地生活着。小时候的我，就是这样，既喜欢这样撒娇，又喜欢疯疯癫癫，头发剪得很短，总是让人觉得我投错了胎。唉，没办法，命中注定的事情，谁也改变不了。小时候，我最喜欢问个为什么。记得一次，外婆家请客。幼稚的我瞪着好奇的眼睛问舅舅：“舅舅，为什么你的肚子这么大？是不是要生孩子啦？是女的还是男的？”舅舅听了我的话，变得特别尴尬。他告诉我，这是啤酒肚。幼稚的我似懂非懂地点了点头??

开始上学了，每天和其他小朋友一样，都背着一个书包，带着好奇踏进学校的大门。好奇与无知总是让我们静不下心来听老师讲课，即使讲得再生动，再有趣，也阻止不了我们对外面世界的热情。终于，有人开始厌学了，有人开始逃学了，老师也不再非常温和，开始用他们那公理哲学教育我们。正处于懵懂时期的我，渐渐明白了许多道理，记住了老师的谆谆教诲，今天过了就是明天，我赢了得了老师的喜爱，也取得了优异的成绩。

站在青春的门槛上，眼前或许仍然是一张张稚嫩的脸，年轻而

篇一：巴金的“爱情三部曲”包括的作品是______。 A.《雾》B.《雨》C

一、整体解读

试卷紧扣教材和考试说明，从考生熟悉的基础知识入手，多角度、多层次地考查了学生的数学理性思维能力及对数学本质的理解能力，立足基础，先易后难，难易适中，强调应用，不偏不怪，达到了“考基础、考能力、考素质”的目标。试卷所涉及的知识内容都在考试大纲的范围内，几乎覆盖了高中所学知识的全部重要内容，体现了“重点知识重点考查”的原则。

1．回归教材，注重基础

试卷遵循了考查基础知识为主体的原则，尤其是考试说明中的大部分知识点均有涉及，其中应用题与抗战胜利70周年为背景，把爱国主义教育渗透到试题当中，使学生感受到了数学的育才价值，所有这些题目的设计都回归教材和中学教学实际，操作性强。

2．适当设置题目难度与区分度

选择题第12题和填空题第16题以及解答题的第21题，都是综合性问题，难度较大，学生不仅要有较强的分析问题和解决问题的能力，以及扎实深厚的数学基本功，而且还要掌握必须的数学思想与方法，否则在有限的时间内，很难完成。

3．布局合理，考查全面，着重数学方法和数学思想的考察

在选择题，填空题，解答题和三选一问题中，试卷均对高中数学中的重点内容进行了反复考查。包括函数，三角函数，数列

教材使用的三部曲 教研室 张建超

教材的概念分广义和狭义两种，广义的是指除了课本以外的其他辅助教学材料，如教参、教学挂图，还包括教师自己制作的课件、教具等；狭义的则单指教科书，或者课本，包括课文、练习、编排和图画等。

现行的课本都是义务教育课程标准实验教科书，尽管编排体系和选取内容各有侧重，但结果指向都是相同的，都是在引导和帮助师生落实课标精神和一些软硬指标，比如课标中学段目标。由“一标多本”的现实来看，教材就是教和学的材料，是实现三维目标的有效载体。教材的有效使用一般要经历三个阶段，即对话教材、解说教材和使用教材。

一、对话教材

省小学语文教研员时广政老师的话：“教什么”的问题到现在还是没有解决好。每一个教师都要积极参与到对教材的再开发过程中来。尽力做到“三从”、“四抓”—— （1）从大处来着眼。依据课标所规定的学段目标入手，确定教学目标。既不降低要求，也不越位。（2）要从具体入手。即依据教材所要求完成的具体教学任务入手。（3）从学生实际出发。根据学生已有的知识基础、能力实际、习惯情况来设计语文教学。教师要细读文本，抓好四个要点：既抓研究语言，抓内容细节，抓课文结构，抓写作背景。

上海师大教授王荣生认为，要做好阅读教学的两个转向：从关注教

在弟弟妹妹的眼中，我是大姐大”；在同学们的心目中，我是大高个儿”；在老师看来，我是一个有责任心的班干部”；其实，我还是一个爱哭的女孩子。

记得有天夜晚，月亮的光芒虽然皎洁，但密密麻麻的乌云，就好似一张黑漆漆的巨大幕布，遮住了原本明亮而温柔的月光，使得月亮变得朦朦胧胧。风不经意间用力地一吹，楼下的树木沙沙”作响，让人不禁毛发直立，顿觉寒气袭来，十分可怖。

爸爸妈妈正好不在家，我心里本来就没底，总感觉有人在背后偷看似的，后背凉飕飕的。在这样一个夜晚，只有我一个人在家，心里就像有几十头小鹿在上蹿下跳地咚咚”乱撞。

哗”忽然间，下起了倾盆大雨，月亮好似变色龙”一样，瞬间消失；轰隆隆”三个响彻天际的雷声如同赶公交车的乘客一般，一个紧接着一个。惊魂未定的我突然被吓得六神无主，眼泪已经呼之欲出，直在眼眶里打转但心里还有一丝意念：不能哭、不能哭

过了好一会儿，我的心情才渐渐平静下来。我以为没事了，便蹑手蹑脚地走进客厅，鬼呀”我被吓得蹲在了地上，双手环着膝盖，头掩在腿上。原来，就在这时，窗帘无缘无故地鼓了起来，伴随着外面的下雨声，这不就是电影里幽灵出现时的情景吗

读《育人三部曲》有感

今年暑假，为了完成学校布置的假期作业，借着暑期闲暇的时光，我有幸拜读了苏霍姆林斯基的《育人三部曲》，本书由三部名著构成：一是《把整个心灵献给孩子》——它涉及的是小学儿童阶段的乐学生活；二是《公民的诞生》——它涉及的是中学少年阶段的和谐发展；三是《给儿子的信》——它涉及的是大学青年阶段的成才修养。这三部著作都是各自独立完整的作品，但它们作为三部曲结合在一起，综合地、全面系统地阐述了苏霍姆林斯基的全面发展教育思想。

在这三部名著中给我印象最深的就是《把整个心灵献给孩子》。这本书以散文般的文笔，夹叙夹议地诉说教育的情感、思想、智慧和美。细细品读，徜徉在大师的教育精髓中，我情不自禁地被这位教育同仁景仰的老人的教育机智和教育灵性所打动。但给我感受最深的还是充盈于字里行间的、那浓浓的——爱。包括他对教育事业执着的爱，对孩子真挚的爱，以及对孩子实施的爱的教育，他对孩子的爱，不仅是一种教育艺术，一种教育策略或技巧，更是从心底散发出来的人性芬芳，让我不禁对自己的教育教学工作有了深刻的反思，同时也受到了很大的启发。

一、爱孩子

作为教师最基本的条件之一就是爱孩子。从书中我感悟到大师对孩子的爱是始终如一的，坚持不懈的，面向全体的。更重要的是，

“后进生”转化三部曲

后进生，俗名“差生”。执教一个班级，老师总会碰到一部分“后进生”。他们要么学习差，要

么行为差，要么态度差，如此总总，总是让教师头痛不已。但是后进生是人，不是产品，不

能当成次品或废品再回炉。教师转化一个后进生，实际上是一个功德无量的善举，是给同样

头疼的父母雪中送炭。那么，如何在课程改革的今天，尽善尽美地转化差生呢？现将效果较

好的方法总结如下：

一、情感转化

列宁说：“没有人的情感，就从来没有，也不可能有对于真理的追求。”对于青少年更是如此。他们不大善于用理智支配情感，却常常以情感支配和影响理智。鉴于此，努力增进师生之间

的情感，加强师生的心理交流，调动非智力因素，激励智力因素势在必得。

教师的情感是影响学生的众多因素中最积极最活跃的因素，这种情感体现在对学生的学习上，不仅是一种力量，还有激发学生求知和愉悦的功能。为使情感能融洽的交流，首先要有一个

愉悦和谐的课堂气氛。我每次带着愉快的心情走进教室，抑制自己一切不良心境，语言亲切

和蔼，用尊重学生的爱心换取学生的理解和尊重，并将我热爱数学、乐教的情感传递给大家。在成绩面前师生共同感到喜悦，在失误的时候互不抱怨，师生间逐步形成一种荣辱与共的依

赖感，有了这种感情，学生在课堂上的思维慢慢活跃起来

夏天到了，火辣辣的阳光照着地面，就像给大地盖上了一个大蒸炉，森林里的万物都是一副无精打采的样子。

小草无力地垂着腰，小树愁眉苦脸的，小花也有些要昏昏欲睡的样子，不一会儿一片花丛就变得东倒西歪。知了也唱着自己编创的热之歌”哎，热呀！哎，热呀”可是太阳似乎并没有理会它们，把空调”的温度调到最高，吹出的风全是热风。小鸟不停地飞来飞去，一会儿不停地扇动着自己的翅膀，想给自己降温一会儿飞到更茂盛的一棵树上，争取更多的荫蔽，一会儿飞到水边，痛快地喝了一大口水后来，雨姑娘看见了大家愁眉苦脸的样子，决定下一场及时作文雨。

哗啦啦，哗啦啦”雨姑娘带走了太阳，风婆婆吹走了炎热，雷公公敲起了鼓，森林里的万物顿时一阵狂喜。小草把叶片摆平，让雨水淋在叶片上，激动地说：太好了！”下雨啦！我已经两个月没喝水了，今天一定要好好享受一番。”花儿仰起头，张开小嘴，甘甜的雨水一滴一滴地落在她的嘴里。小树开心地洗着澡，知了唱起了凉爽歌”小鸟快活地飞来飞去，到处一片欢声笑语的景象。

雨停了，天空出现了一道美丽的彩虹。大家望着天空，快活地交谈着。蝴蝶们开心地在空中翩翩起舞，小鸟现在小树的枝头，唱着优美的歌曲。