生化实验指导

生物化学实验指导

海洋学院生物化学课程组编

2008年7月22日

目 录

实验室守则 ???????????????????????????????? 2 实验一 糖类的定量测定 ???????????????????????? 4 实验二 薄层层析法分析氨基酸 ????????????????????? 7 实验三 氨基酸含量的测定 ??????????????????????? 9 实验四 酪蛋白的制备 ????????????????????????? 11 实验五 考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白质含量 ????????????? 13 实验六 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ????????????????? 17 实验七 DNA的提取制备 ???????????????????????? 29 实验八 酶活性的测定 ????????????????????????? 33 实验九 过氧化物酶同工酶分析 ????????????????????? 37 海洋学院实验记录的基本要求 ???????????????????????42 实验报告撰写要求 ????????????????

生化技术实验指导书

湖北工业大学生物工程学院

二0一0年三月修订

实验一 酵母RNA的提取及其组分的鉴定

一、 实验目的

1. 了解稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的基本原理； 2. 掌握稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的具体操作方法。 二、 实验原理

酵母中RNA的含量比较丰富（2.67%~10%），而DNA的含量相对地较少（据资料报道，酵母DNA的含量低于RNA的20%），因此从酵母中提取RNA比较方便。RNA溶于碱性溶液，碱性溶液使蛋白质带负电荷，促进RNA(带负电荷)与蛋白质的分离，碱性溶液可使酵母细胞壁变性，同时进行加热，可增加细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。因此，酵母粉用稀碱液加热抽提时，可将其中的RNA抽提出来。当碱性抽提液中和后，加入2倍体积的95%乙醇时，可以使抽提物沉淀出来。抽提物的主要成分是RNA的钠盐，并带有少量的蛋白质。用碱抽提时，RNA会有不同程度的降解。

地衣酚（3，5-二羟基甲苯）是比较灵敏的测定戊糖的试剂，常用于测定RNA。核糖与地衣酚试剂反应呈现鲜绿色。地衣酚试剂反应灵敏，也易被其他物质干扰。DNA中的脱氧核糖也可与地衣酚反应，因此，单靠地衣酚显色实验不能作为RNA与DNA鉴别依据。

二苯胺试剂是常

生化工程与设备实验指导书

实验一、停留时间分布测定实验

1、目的及意义

通过实验掌握停留时间分布的测定方法，由测定结果判断物料的先进先出

性，它的意义是为了更好的指导有关设备的设计，更好的满足工艺要求。在酒精生产过程中的物料连续蒸煮，淀粉糖生产过程中的粉浆连续液化液；深层液体发酵培养基的连续灭菌等，这些从工艺要求，都要求物料先进先出，能不能保证物料的先进先出，决定容器设备的设计，即容器设备的高径比不同，高径比大的物料先进先出性好，反之差，在生产中用几个罐串联，其实质是增加了容器的高径比，通过实验对设备结构、设计的理论加深理解。

2、实验内容

以玻璃柱为容器，以水为物料，用盐酸作示踪物，当水稳定流入玻璃容器

后，用注射器在容器的进口处瞬时注射一定量的盐酸，同时计时，在出料口间隔取样，记好每个取样样的时间，用氢氧化钠溶液滴定取样中的酸量，以时间为横坐标，酸的浓度为纵坐标，做出正态分布图。

3、实验仪器

1）停留柱

A）型 Φ25；H=400 （两个），Φ25；H=200（单个） V总=320mL（三个串联） B）型 Φ50；H=180 V=320ml (单个) C）型 Φ30；H=560 V=320ml, （单个） （每组任选一型） 2) Φ8胶管； 3)1

※ 实验一 糖的性质实验

糖的颜色反应

※ 实验一（1）

【实验目的及要求】

1. 掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。 2. 掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。 【实验原理】

1．莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。

2．塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。 【实验仪器及用品】

仪器：水浴锅。 器皿：吸管、试管。

实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。 【实验试剂】

莫式试剂：а-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。 塞式试剂：间苯二酚50mg，溶于100ml盐酸（VH2O：VHCl=2:1），现用现配。 【实验内容及步骤】

一、莫式实验

于4支试管中，分别加入1 ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1 ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜

实 验 讲 义

基础实验

生物科学与工程学院1

生 化

实验一 实验基本操作技能培训

一、 仪器的洗涤与干燥 1. 仪器的洗涤

化学实验中经常使用的玻璃仪器和瓷器，常常由于污物和杂质的存在而得不出正确的 结果。因此，在进行化学实验时，必须把仪器洗涤干净。玻璃仪器的洗涤方法很多，应根据实验的要求、污物的性质、沾污程度来选择。常用的洗涤方法如下：

(1)用水刷洗

用水和毛刷刷洗，再用自来水冲洗几次，可除去附在仪器上的尘土、可溶性和不溶性杂质。注意洗刷时不能用秃顶的毛刷，也不能用力过猛，否则会戳破仪器。

(2)用去污粉、肥皂洗、洗衣粉、洗涤剂洗

去污粉由碳酸钠、白土、细砂等组成，它与肥皂、合成洗涤剂一样，能去除油污和一些有机物。由于去污粉中细砂的摩擦和白土的吸附作用，使得洗涤的效果更好。洗涤时，可用少量水将要洗的仪器润湿，用毛刷蘸取少量去污粉刷洗仪器的内外壁，最后用自来水冲洗。 用去污粉、洗衣粉、洗涤剂洗这些洗涤剂可以洗去油污和有机物质。若油污和有机物质仍然洗不干净，可用热的碱液洗。 (3)用铬酸洗液洗

铬酸洗液是由浓硫酸和重铬酸钾配制而成的，具有很强的氧化性，对有机物和油污的去污能力特别强。使用铬酸洗液时要注意被洗涤的仪器内不宜有水，

实验一 糖的颜色反应及还原性检验

A. 莫氏试验①

一、目的

掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。

二、原理

糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用

②

下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物。利用这一性质可以鉴定糖。

三、实验器材

棉花或滤纸；吸管1.0ml（×5）、2ml（×1）；试管1.5cm×15cm（×5）；容量瓶50ml（×5）；烧杯50ml（×5）；棕色瓶50ml（×5）；玻璃棒多根、电炉（配石棉网）多个。

四、实验试剂

莫氏试剂：称取α-萘酚2.5g，溶于95％乙醇并稀释至50ml。此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。

1％蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。

1％葡萄糖溶液：称取葡萄糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。 1％果糖溶液：称取果糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。

1％淀粉溶液：将0.5g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至50ml。

五、操作

于5支试管中，分别加入1％葡萄糖溶液、1％蔗糖溶液、1％果糖溶液与1％淀粉溶

①

液1 mL和少许纤维素（棉花或滤纸少量浸在1ml水中），然后各加莫

生物化学检验技术 课程学习指南

（适用于医学检验专业专科使用）

生化检验课程学习指南

生物化学及检验教研室编

一、课程简介

《生物化学检验》(临床生物化学检验、临床生化检验、生化检验、生化检验学、临床生物化学和生物化学检验、临床生物化学及生物化学检验、临床生物化学、临床化学等)是对人体健康和患病时化学状态的研究以及用于诊断、治疗和预防疾病的化学试验方法的应用。它的主要任务是研究人体器官、组织、体液的化学组成和进行着的生化过程，以及疾病、药物对这些过程的影响，为疾病诊断、病情监测、药物疗效、预后判断和疾病预防等各个方面提供信息和理论依据。因此，《生物化学检验》既是一门研究人体健康和疾病时生理生化过程的医学基础理论学科，又是一门应用各种技术和方法分析机体健康和疾病时体液或组织样品中各种化学成分的医学应用技术学科，它在医学理论和医学实践中均具有相当重要的地位，是高等医学检验专业的一门主干学科和必修课程。

（一）课程目标

通过本课程的学习，要求学生掌握生物化学检验的基础理论、基本知识和基本技能，能够从事检验医学的生化实验诊断操作、评价和应用，培养成为医学检验技术专业高级专门人才。具体归纳为：

1、掌握生物化学检验的基本理论、基本知识； 2、具有娴熟

实 验 讲 义

基础实验

生物科学与工程学院1

生 化

实验一 实验基本操作技能培训

一、 仪器的洗涤与干燥 1. 仪器的洗涤

化学实验中经常使用的玻璃仪器和瓷器，常常由于污物和杂质的存在而得不出正确的 结果。因此，在进行化学实验时，必须把仪器洗涤干净。玻璃仪器的洗涤方法很多，应根据实验的要求、污物的性质、沾污程度来选择。常用的洗涤方法如下：

(1)用水刷洗

用水和毛刷刷洗，再用自来水冲洗几次，可除去附在仪器上的尘土、可溶性和不溶性杂质。注意洗刷时不能用秃顶的毛刷，也不能用力过猛，否则会戳破仪器。

(2)用去污粉、肥皂洗、洗衣粉、洗涤剂洗

去污粉由碳酸钠、白土、细砂等组成，它与肥皂、合成洗涤剂一样，能去除油污和一些有机物。由于去污粉中细砂的摩擦和白土的吸附作用，使得洗涤的效果更好。洗涤时，可用少量水将要洗的仪器润湿，用毛刷蘸取少量去污粉刷洗仪器的内外壁，最后用自来水冲洗。 用去污粉、洗衣粉、洗涤剂洗这些洗涤剂可以洗去油污和有机物质。若油污和有机物质仍然洗不干净，可用热的碱液洗。 (3)用铬酸洗液洗

铬酸洗液是由浓硫酸和重铬酸钾配制而成的，具有很强的氧化性，对有机物和油污的去污能力特别强。使用铬酸洗液时要注意被洗涤的仪器内不宜有水，

一 蛋白质提取、纯化及分析技术

实验一 多酚氧化酶（PPO）的分离提取

一、材料与试剂

（1）马铃薯（大约每小组200-300g） （2）试剂：

0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001m EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m巯基乙醇，0.001m EDTA，0.005m MgCL2）配置时配。 （3）实验器械与仪器设备：

试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机； DL-7A大容量低速冷冻离心机 二、操作步骤

1：粗酶提取：

马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001m EDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。 2：盐析分级沉淀：

在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和

实验一 植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法 P199

原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫。其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。 ①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。

②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺。

材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。

实验步骤：

分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，加入5ml醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无氨蒸馏水稀释至100ml。用干燥滤纸过滤到三角瓶中。如下操作 试管编号 试剂 样品提取液ml 无氨蒸馏水ml 0.1抗坏血酸ml 水合茚三酮ml 570nmOD值 每管含氮量 0 0 空白1 0 2.0 0.1 3 0.130 1.26 样品1（未萌发） 2 2 0 0.1 3 0.123 1.19 3 2 0 0.1 3 0.188 1．83 样品2（萌发） 4 2 0 0.1 3 0.168 1.83 5 2 0 0.1 3 置于沸水中加热15min，取出用