重组DNA和基因表达载体的区别

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2运载体与基因表达载体的区别

1、不同点：

⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将目的基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。

相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目的基因这一功能，只要能运输目的基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目的基因。

⑵“基因表达载体”，是实施了运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。

这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同。

2、联系：

“基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的。

基因表达载体的构成：目的基因+ 启动子+ 终止子+ 标记基因。

3、表达载体上的启动子和终止子是本身具有还是后加上去的呢？

这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人的观点是：这要看获取目的基因的方法，而问题的根源在于基因的结构。关于基因的结构，在新课程标准中也不再做为教学的要求了。

（人类）结构基因的基本结构：上游非编码区+ 启动子+ 编码区+ 终止子+ 下游非编码区

人类结构基因4个区域：

①前导区，位于编码区上游，相当于RNA5’末端非编码区（非翻译区）；

②编码区，包括外显子与内含子；

③尾部区，位于RNA3’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；

④调控区，包括

重组DNA技术与基因工程1 2 3 4 5 6 重组DNA技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程

目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母中的表达

5 外源基因在大肠杆菌中的表达A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定

被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物

5 外源基因在大肠杆菌中的表达A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白

细胞周质内含有种类繁多的内毒素

5 外源基因在大肠杆菌中的表达B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子 终止子

核糖体结合位点密码子 质粒拷贝数

启动子 启动子最佳距离的探测A

目的基因 E E

启动子

目的基因 E E

A 酶切开

Bal31酶解

启动子 启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段

克隆到启动子探针质粒pKO1上。 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk

实验报告

题目:单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达

指导老师:邓庆丽

日期:2013/10/31-201311/1

一．实验目的：

(1)了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。 (2)了解降解物阻遏的现象及其机理。 二．实验原理：

本实验使用的是载体是已重组好的 pGFPuv ，宿主细胞为大肠杆菌，目的基因的产物为融合蛋白，目的蛋白为绿色荧光蛋白GFP，非目的蛋白即融合部分为标签6×His，用于单元

四的亲和层析分析。

本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。 操纵子是原核基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成，如下图1所示：

乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。 (1)诱导表达

当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实验中的绿色荧光蛋白基因GFP）不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处

关于表达载体的构建

1. 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类

载体既有复制子，更要有强启动子； 2. 大肠杆菌中的表达载体应含有 （1）强启动子

（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。

（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。

我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。

3. 载体构建的步骤 （1）.设计引物

1.引物的长度 用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

3. Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则

第5章第1节

基因突变 和基因重组

熟练掌握基因突变和基因重组的概念、种 类、时间、原因、特点、意义。

问题探讨三位同学在抄写英语句子“THE CAT SAT ON THE MAT (猫坐在草席上) ” 时，分别抄成了以下的句子： THE KAT SAT ON THE MAT THE HAT SAT ON THE MAT 与原来的句子相比较，意思发生了什 么变化呢？ 假如在DNA分子的复制过程中，发生 了类似的错误，DNA分子所携带的遗 传信息将会发生怎样的变化？这样的 变化可能对生物体产生什么影响？

复习:表现型与基因型的关系 表现型 (改变) 基因型 + (改变) 环境条件 (改变)

引入:生物体遗传性状的改变就是生 物的变异

生物界中的变异现象

什么叫“生物的变异”?

生物体亲代和子代 之间以及子代个体 之间性状的差异性。

变异能否遗传？

两只青蛙相爱了, 结婚后生了一个癞蛤蟆, 公青蛙见状大怒说:贱人,怎么回事? 母青蛙哭着说:他爹,认识你之前我整过容.

为什么这种变异性状不能遗传给子代？分析：是环境因素引起的 ，自身的遗传物质没有 改变。 以上都属于不可遗传的变异

可遗传的变异

太空椒(经过太空遨游，也就是经过辐射的) 和普通椒相比，太空椒具有明显的优势，果

第14章

基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering

目录

DNA克隆、测序与重组技术的历史 1973年，Stanley Cohen等人首次获得体外 重组DNA的分子克隆 1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert的 化学裂解DNA测序问世 不久，Sanger 等的双脱氧测序法

20世纪90年代启动人类基因组计划(human genome project,HGP) 重组DNA技术学(Recombinant DNA Technology)目录

第一节

自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录

DNA重组 一、同源重组 (homologous recombination) 二、细菌的基因转移和重组

1、接合作用 (conjugation) 2、转化作用 (transformation)3、转导作用 (transduction)

三、位点特异的重组(site-specific recombination) 四、转 座 (transpos

第5章第1节

基因突变 和基因重组

熟练掌握基因突变和基因重组的概念、种 类、时间、原因、特点、意义。

问题探讨三位同学在抄写英语句子“THE CAT SAT ON THE MAT (猫坐在草席上) ” 时，分别抄成了以下的句子： THE KAT SAT ON THE MAT THE HAT SAT ON THE MAT 与原来的句子相比较，意思发生了什 么变化呢？ 假如在DNA分子的复制过程中，发生 了类似的错误，DNA分子所携带的遗 传信息将会发生怎样的变化？这样的 变化可能对生物体产生什么影响？

复习:表现型与基因型的关系 表现型 (改变) 基因型 + (改变) 环境条件 (改变)

引入:生物体遗传性状的改变就是生 物的变异

生物界中的变异现象

什么叫“生物的变异”?

生物体亲代和子代 之间以及子代个体 之间性状的差异性。

变异能否遗传？

两只青蛙相爱了, 结婚后生了一个癞蛤蟆, 公青蛙见状大怒说:贱人,怎么回事? 母青蛙哭着说:他爹,认识你之前我整过容.

为什么这种变异性状不能遗传给子代？分析：是环境因素引起的 ，自身的遗传物质没有 改变。 以上都属于不可遗传的变异

可遗传的变异

太空椒(经过太空遨游，也就是经过辐射的) 和普通椒相比，太空椒具有明显的优势，果

脂联素

H nij n ln cn eeo g aA ig ic il am eS4

a d VeeayMei ie n it r rcn dn

N 2 0 9 o1 2 0

脂牛素基因联真核表达体载构建的及鉴定黄海龙 王，哲 于健国孙，,佳 (吉.大学林畜牧兽医学院，1吉长林春10;.63022林吉农业大学动科学技物术院，学吉林长春10 1 3)18 图分中号类 8: 32￥文献标识码： 文章编A号：40 04—2 02— )0—43 10 73 0(9 1 000

关键词：;牛脂联素基因；真核表达载摘体：要了构建脂联牛素基真核表达载体因，为试验采用 RT— P方法扩增R牛脂联素 o(iae iC b vd— n pcnB vnD 基N因 o,e t oA, P i)将其克隆到p 1 M D一8T体载中，正序的质确粒经 Eo I和 N测 ctR Io双酶 ,切回收目基的片因将段定其向克隆到pIZ tC o A载体P中，建重质粒组p Z￣I oA P结果表。构 P C Bo vDN A明：克隆基因的序与 G n列 ka Be n布的公序有 10列 0%同源性的；目的基因向正插入，阅读框正确无误 ,说牛明脂联素基因真核表达载体构建功成。C

第14章

基因重组和基因工程Genetic Recombination and Genetic Engineering

目录

第一节

自然界DNA重组和基因转移 是经常发生的DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录

第二节 重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone

目录

重组DNA技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传 工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的

药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。

目录

本节主要内容： 相关概念

DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体

基本原理 重组DNA技术与医学的关系

目录

一、重组DNA技术相关概念(一)

专题1 基因工程基因工程是指按照人 们的愿望，进行严格 的设计，并通过体外 DNA重组和转基因等技 术，赋予生物以新的 遗传特性，从而创造 出更符合人们需要的 新的生物类型和生物 产品。由于基因工程 是在 DNA 分子水平上进 行设计和施工的，因 此又叫做DNA重组技术。

能否培养出具有抗虫 性状的抗虫棉呢？

胰岛素是治疗糖尿病的特效药,长期以来只 能从猪、牛等动物的胰腺中提取，产量低 成本高。 而微生物生长迅速，容易控制。于是科学 家设想，若能将人的胰岛素基因导入微生 物体内，并得以表达，就不仅能解决产量 问题，还能大大降低生产成本，使药品价 格大幅下降。 能否让微生物产生出人的 胰岛素等珍贵药物？

这些定向改造生物的设想能 实现么？ 经过多年的努力，科学家 终于在20世纪70年代创立了 可以定向改造生物的新技术

——基因工程

一、基因工程的概念：优点： 又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通 俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物 定向地改造生物的遗传性状； 的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后 实现基因在不同物种之间的转移，迅速培育 放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物 出生物新品种 的遗传性状。原理 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程