细胞爬片免疫荧光实验

细胞爬片免疫荧光实验步骤

第一天：

1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；

3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；

5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

第二天：

6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

细胞免疫荧光步骤

1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000左右

2.给药处理24h

细胞免疫荧光染色

1. 盖玻片处理：用前1天用纱布擦净灭菌，放入6孔板。

2. 接种细胞：较低密度为适宜，约2000－10000个/孔（根据细胞生长状态决定，常用

5000个/孔），2ml（浓度为2500/ml）

3. 24h后细胞贴壁，根据需要同步16－18h，干预处理，细胞融合60－70％时染色最

佳

4. 37度PBS洗涤，3ml/孔，贴边加（可将6孔板倾斜，加完样在放正以防冲掉细胞，

0.5min。室温PBS也可，但4度禁止，否则细胞易皱缩。

5. 固定：4％多聚甲醛(1ml)，先常温稳定5min，然后4度，10min，（可放在饭盒内）。 6. 吸掉多聚甲醛，迅速加PBS 5ml/孔，洗涤5min×3次，镜下观察，细胞形态如前。 7. 透化：0.1％－4％triton×－100，1ml/孔，室温透化5min（triton是去污剂，目的是

将脂质成分破坏，如细胞膜、核膜等，故不影响实验结果，可不用洗涤）

8. 5％BSA（滤过）室温封闭至少20min（可配制含5％BSA和0.2％triton的混合液，将

两步合成一步）风干

9. 用5％BSA将一抗1：50或1：100（常用）稀释至EP管 200ul/玻片 10. 将纱布垫在饭盒中，去离子水润湿纱

免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）

荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。

抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。

抗核抗体实验原理

以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。

免疫荧光法用于生殖道感染检测的应用申请

尊敬的院领导：

为提升临床生殖道感染病原体检测效果和创造更为客观的社会效益与经济效益，我科室申请开展生殖道感染病原体免疫荧光法检测项目，具体包括沙眼衣原体、阴道加德纳菌、奈瑟氏淋球菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫、单纯疱疹病毒II型共6种病原体的免疫荧光法快速检测，单项检测的收费价格为 元/例，预计每月的样本量约在 例左右。另附详细的申请报告。

一、在妇、产科开展免疫荧光技术的背景

生殖道感染(RTI)是由于受细菌、病毒、衣原体、真菌、原虫等多种病原体的侵袭，引起男女性生殖道感染的一大类传染病的总称，包括细菌性阴道病、假丝酵母菌病、滴虫性阴道炎、性传播疾病(STD)等。有资料显示，生殖道感染病例中男女比例为1:3.3-5.9，所以说生殖道感染对广大育龄妇女的危害远大于男性，该系列疾病严重威胁到广大育龄妇女的生殖健康和身心健康，目前已成为全球特别是发展中国家非常关注的生殖健康和公共卫生问题。曾有机构对在妇科门诊和产前检查门诊就诊的患者中进行调查，18岁-45岁的育龄妇女中STDs的患病率高达34.85%，对于育龄妇女而言，生殖感染的危害不仅限于妇女本身，同时也会对下一代的健康产生影响，导致不孕不育、早产、

实验九 组织切片与细胞爬片/涂片的HE染色

【实验目的】

1．掌握细胞涂片的HE染色方法 2．熟悉细胞涂片及爬片的制备方法 【实验原理】

苏木素-伊红染色又称HE染色，是目前应用最广泛的染色方法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色主要用于显示各种组织的正常成分和病变组织的一般形态结构，各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复的全过程，在质量较佳的HE染色切片上，基本上都可以观察到，从而进行判定或研究。HE染色适用于各种固定、包埋方法制作的石蜡切片、冰冻切片和细胞涂片，且切片不易褪色，可以长期保存。HE染色在病理诊断、教学和科研中具有重要的价值。

【实验方法】 1．细胞爬片的制备

（1）将灭菌的载玻片放入培养板内。

（2）将培养好的贴壁细胞消化后离心，计数，按照一定的细胞密度加入孔板中，根据实验目的选择培养基或加入药物。

（3）将孔板放入37℃二氧化碳孵箱中孵育数小时或过夜，待细胞的贴壁密度符合实验要求时，吸去孔板内的培养基或药物，用37℃预温的0.1mol/L PBS漂洗一次。

（4）吸去孔板内的PBS液，加入4%多聚甲醛室

学习目标 掌握 HSC功能特征 掌握阳性和阴性选择的生物学意义 罗列 T 、 B 细胞的主要表面标志，并掌握其功能:-TCR-CD3 complex; -BCR complex; -coreceptors; -co-stimulatory molecules and co-stimulatory receptors

掌握T、B细胞的分类方法与功能 掌握 NK 细胞的特点

I 免疫系统:

概述

Tissues and organs Cells Molecules

免疫细胞的类型Cells of adaptive immune systemAntigen specific lymphocytes (T,B cells) Antigen presenting cells抗原提呈细胞

Cells of innate immune systemMononuclear phagocytes 单核-巨噬细胞 Granulocytic cells 粒细胞 Mast cells 肥大细胞 Natural killer cells 自然杀伤细胞 Platelets 血小板4

Hematopoietic Stem Cell (HSC ) 造血干细胞 H

学习目标 掌握 HSC功能特征 掌握阳性和阴性选择的生物学意义 罗列 T 、 B 细胞的主要表面标志，并掌握其功能:-TCR-CD3 complex; -BCR complex; -coreceptors; -co-stimulatory molecules and co-stimulatory receptors

掌握T、B细胞的分类方法与功能 掌握 NK 细胞的特点

I 免疫系统:

概述

Tissues and organs Cells Molecules

免疫细胞的类型Cells of adaptive immune systemAntigen specific lymphocytes (T,B cells) Antigen presenting cells抗原提呈细胞

Cells of innate immune systemMononuclear phagocytes 单核-巨噬细胞 Granulocytic cells 粒细胞 Mast cells 肥大细胞 Natural killer cells 自然杀伤细胞 Platelets 血小板4

Hematopoietic Stem Cell (HSC ) 造血干细胞 H

　　我们知道，我们的身体是一个由细胞构成的王国，极其精密复杂，同时又高度有序。任何伟大的王国都既需要能干建设者，也需要勇猛防卫兵，我们身体细胞王国也不例外。

　　两者功能有什么不同

　　当我们的人体还在成长时，干细胞是细胞王国的建设者，通过分化源源不断提供新生细胞，增加我们身体细胞的数量;当我们成年后身体不再成长，干细胞又会扮演细胞王国的维护者，及时替换和更新衰老或受损的细胞。

　　干细胞是建设者

　　当有外敌入侵，如细菌和病毒，免疫细胞就会扮演细胞王国的军队，快速反应，将其清除。如果细胞王国中出现叛变分子，如正常细胞突变为癌细胞，免疫细胞就会扮演安保系统，将其识别并清除。

　　免疫细胞是防卫者

　　当外敌入侵过多，或王国内叛变分子太多，免疫细胞没有能力全部清除时，我们的身体就会生病。

　　两者如何分类

　　现在，让我们来进一步分别了解干细胞和免疫细胞，他们都分哪些种类，不同种类功能有何差异：

　　(1)按照分化潜能分类，干细胞分为：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。

　　如果把人体比喻为一棵树，深埋大地的种子就是全能干细胞，就如同种子可以发育成长为一颗参天大树。

　　大树的主要枝干可以比喻为多能干细胞，如脐带/胎盘间充质干细胞，可以向

第八章荧光免疫技术

FluoreSCenCe ImmunoaSsay

第一部分 目的要求和教学内容

一、目的要求

掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术 的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技 术主要类型的技术要点。 二、教学内容

1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。

2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。 3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点， 方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价 和临床应用)。

第二部分 测 试 题 一、选择题

(一)单项选择题(A型题)

1.如下有关荧光免疫技术正确的提法 A．直观性检测抗原和抗体 B．直观性检测抗原 C．直观性检测抗体

D．间接检测抗原或抗体

E．间接检测抗原和抗体

2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度 A．10～15℃ B．15～20℃ C．20～25℃

D．25～30℃

Protocol

RNA FISH on Cultured Cells in Interphase

1. Ng Karen1 and 2. Anton Wutz + Author Affiliations 1. Research Institute of Molecular Pathology (IMP), 1030 Vienna, Austria 1. ?1Corresponding author (ng@imp.univie.ac.at)

Next Section

INTRODUCTION

Fluorescence in situ hybridization (FISH) has become a widely used method in genome and molecular genetic studies. The technique is highly versatile and has been adapted to carry out genome-wide screenings, microarray quantifications, cancer cytogenetics analysis, and RNA ex