体外蛋白表达系统

高效蛋白质表达系统1. 原核表达系统 (1)Gram negative (E. coli) (2)Gram positive (B. subtilis) 2. 真核表达系统 (1) Yeast (2) Baculovirus (3) Drosophila (4) Mammalian cells (COS, CHO, BHK etc.) 3. 其它 (1) Cell-free system (2) Protoblast

Protein Expression

Protein expression is a subcomponent of gene expression. It consists of the stages after DNA has been translated into amino acid chains, which are ultimately folded into proteins. In its simplest form, a protein expression system involves a template, a mechanism of transcription/translation such as

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常见蛋白表达系统的比较

在生物学研究中，重组蛋白的研究越来越受到关注，而重组蛋白最为重要的莫过于表达系统的选择。蛋白表达系统是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。常见的蛋白表达系统分为原核表达系统和真核表达系统，具体又可以细分多种，每一种有各自的优缺点。在此，小编给大家整理了各表达系统间的差异，供大家参考。

表达系统 原核生物 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 代表工程菌株 BL21-PET系统 特点 具有原核细胞良好的可操作性，成本低，产率高，但不能进行糖基化修饰，胞内分泌形成包涵体，且易产生内毒素。 产量 外源蛋白占细菌总蛋白量：胞内表达10%-70%，胞外表达0.3%-4%。 B．subtilis系细胞壁不含内毒素，很强统、B. brevis系的胞外分泌蛋白能力，蛋统 白酶易对目的蛋白降解，重组表达质粒不稳定，真核蛋白分泌量低。 酿酒酵母 兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力，但存在产量低及过度糖基化等问题。 外源蛋白占菌体总蛋白量： 10%-30%。 酵母 外源蛋白占菌体总蛋白量：约10%。 甲醇营养型 酵

1．培养基的配制

原理

http://wenku.http://www.wodefanwen.com//link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44FsTWICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7

步骤

LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。

LB培养基的配制：

成分

胰蛋白胨(tryptone) 10g

酵母提取物(yeast extract) 5g

氯化钠(NaCl) 10g

固体培养基另加 琼脂粉 15-20g

加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min

配制方法

（1）称量 分别称取所

1．培养基的配制

原理

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步骤

LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。

LB培养基的配制：

成分

胰蛋白胨(tryptone) 10g

酵母提取物(yeast extract) 5g

氯化钠(NaCl) 10g

固体培养基另加 琼脂粉 15-20g

加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min

配制方法

（1）称量 分别称取所

酿酒酵母表达系统-半乳糖诱导外源蛋白表达实验

培养基：

SC尿嘧啶缺陷培养基（2%GLucose） SC诱导培养基（2%半乳糖）

贮存液：

20%葡萄糖（W/V） 20%半乳糖（W/V） 贮存液过滤除菌，4℃保存。

SC培养基高温高压灭菌，待培养基温度降低至60℃以下后，加入相应体积的葡萄糖或者半乳糖，混匀，4℃保存备用。

实验流程：

1.将转化pYES2的INVSC单克隆接种到15ml SC（2%葡萄糖）选择培养基中。 2. 30℃震荡过夜培养。

3.测定过夜培养菌液的OD600，计算配制50ml OD600=0.4的菌液所需的过夜培养的菌液体积V。

eg：例如过夜培养菌液OD600=3，则V=（0.4OD/ml）（50ml）/（3OD/ml)=6.67ml。 4.取V体积过夜培养的菌液于50ml离心管中，4℃，1500g，离心5min，收集菌体。

5.用1-2ml SC诱导培养基（SC+2%半乳糖）充分重悬菌体，将诱导培养基补充至50ml，，将菌液全部转移至无菌250ml三角瓶中，30℃震荡培养。 6.分别于接种诱导培养基2,4,6,8h后，取5ml菌液测定OD600。 7.4℃，1500g，离心5min，收集菌体。 8.去上清，用

一、蛋白质纯化流程图

图1 可溶性重组蛋白的纯化图解，这种蛋白质可以被分泌或定位在周质内、膜组分内，或在大多数情况下在细胞质内。第一步是得到含有可溶性目的蛋白的提取物，之后可以进行常规的纯化步骤，或用亲和方法纯化带有标签的融合蛋白。

图2 在宿主细胞的细胞质中以包含体形式生产的不可溶性重组蛋白的纯化图解。必须将细胞破碎开，然后通过差异离心分离不可溶的包含体，使用变性溶剂来溶解，当除去变性剂后，溶解的蛋白质发生复性，还需要进一步的精制步骤来除去少量的污染蛋白质和未正确折叠的蛋白质。

图3 存在于天然宿主细胞中的可溶性蛋白质的纯化图解。必须将细胞破碎，以释放出蛋白质，通常每克细胞加入2-10ml适当的缓冲液，在除去不溶性材料后，处理通常需要几步，按正确的顺序使用各种标准的分级分离方法。要生产高纯度蛋白质，可能会需要最后的精致步骤，以除去最终的微量污染物。

图4 与膜相关的和溶解性差的蛋白质（非重组的）的纯化图解。通过分离含有目的蛋白的细胞器，可以实现第一步的纯化。通常用非离子型去污剂来溶解膜蛋白，尽管松散解离的蛋白质也可以在高pH、含EDTA（或使用少量的有机溶剂，如正丁醇）的条件下不用去污剂来提取，如果自始至终都需要有去污剂来维持蛋白质的完整性，则需要

中国组织工程研究 第21卷 第6期 2017–02–28出版

Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 28, 2017 Vol.21, No.6

www.CRTER.org

转铁蛋白标记磁性脂质体的制备及体外成像 陈维翠1，刘淑仪1，林爱华2，刘 岘1 (广州中医药大学第二附属医院，1影像科，2药学部，广东省广州市 510120) ·研究原著·

引用本文：陈维翠，刘淑仪，林爱华，刘岘. 转铁蛋白标记磁性脂质体的制备及体外成像[J].中国组织工程研究，2017，21(6):923-927.

DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.018 ORCID: 0000-0002-1814-8295(陈维翠)

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转铁蛋白标记磁性脂质体的制备 DSPC+chol+PEG2000-DSPE 理化特性 共价结合法 细胞毒性实验 转铁蛋白 转铁蛋白-磁性纳米粒子 细胞结合实验 转铁蛋白-磁性纳米粒子具有转铁蛋白体外成像实验 受体靶向作用、无明显毒性，满足MR 分子探针的所需要求

昆虫细胞表达系统

昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相

毕赤酵母表达系统步骤

（参考Invitrogen公司说明书）：

一、 pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存

1 取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2 挑取转化子，甘油保存。 二、 载体构建

1 将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。

2 提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3 载体测序

测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物 三、 线性化DNA

1 提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）； 四、线性化DNA的去磷酸化处理 线性化质粒 43μl CIAP Buffer 5μl

CIAP酶 2μl

四、 总体积为50μl的样品37℃ 1h

在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略

本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表[1，2，3]。国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体