乙肝表面抗原定量测定(稀释)

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析

姓名 Z P

学号 0925400072

班级 09

指导老师

方法学验证

级医学检验本科二班 沈 富 兵

二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）

【摘要】 目的 用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法 运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果 HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论 ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。

【关键词】 乙肝表面抗原 方法学验证 标准曲线 精密度 EL

乙肝病毒表面抗原诊断操作规程

一、操作步骤：

1、将试剂盒从冰箱中取出至室温中平衡30分钟后使用。

2、将标本对应微孔按顺序编号。

3、每孔加入待测标本50微升，设阴、阳性对照

各两孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各1滴，并设空白对照1孔。

4、每孔加入酶结合物1滴，（空白对照孔除外）

充分混匀，封板，置37度孵育30分钟。

5、手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，

静置5秒，甩干，重复5次后拍干。

洗板机洗板：选择洗涤5次程序后拍干。6、每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，

封板，置37度孵育15分钟。

7、每孔加终止液1滴，混匀。

8、用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双

波长的酶标仪比色，参考波长630nm），先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。

二、结果判断：

样品OD值/阴性对照平均OD值大于等于2.1判断为阳性，否则为阴性。

阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。

三、注意事项：

1、使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。

2、封片不能重复使用。

3、结果判断须在反映终止后10分钟内完成。

4、不同批号的试剂不可混用。

5、待测标本不可用NaN3防腐，如需稀释标本，请用小牛血清稀释。

6、试剂盒应视为有传染性物质，请按传染

DOI：10.13200/j.cjb.2010.10.51.tengxn.008

·1080·

中国图书分类号Q813.1+1R392-33

中国生物制品学杂志2010年10月第23卷第10期ChinJBiologicalsOctober2010，Vol.23No.10文献标识码A

文章编号1004-5503（2010）10-1080-05

【预防制品】表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反

应器培养

滕小锘

易小萍

孙祥明

张元兴

【摘要】目的优化表达乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的重组CHO细胞的无血清培养基，并进行生物反应器高密度培养。方法通过对现有重组CHO细胞无血清培养基SFMB的氨基酸、蛋白类激素、蛋白水解物等的优化，建立针对表达HBsAg的重组CHO细胞无血清低蛋白（<10mg／L）培养基SFMC。并利用此培养基在生物反应器中分批、流加、灌注悬浮培养重组CHO细胞，通过最大细胞密度和HBsAg产率评价不同的培养模式。结果SFMC与原培养基SFMB相比，使重组CHO细胞的最大细胞密度提高了20%，HBsAg表达量提高了25%。在生物反应器培养过程中，灌注培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率为0.70mg／（L·d），较分批和流加培养的0.30mg／（L·d）提高了约133%。结论养，可显著提高重组CHO细胞表达HBsAg的效率。

【关键词】CHO细胞；肝炎表面抗原，乙型；培养基，无血清；生物反应器

通过无血清培养基优化及生物反应器高密度培

OptimizationofSerum-freeMediumforRecombinantCHOCellsExpressingHBsAgandCultureinBioreactor

TENGXiao-nuo,YIXiao-ping,SUNXiang-ming,Z

篇一：乙肝表面抗体阳性要不要紧

第一：“乙肝表面抗体和核心抗体阳性，其它阴性”这种病人在临床上比较多见，表现为隐袭性感染，无症状而自愈。痊愈后保留了抗-HBs，保护其免受乙肝病毒的二次感染。而抗-HBc则提示了一次乙肝病毒的感染过程。所以说，抗-HBs和抗-HBc阳性是急性乙肝自然痊愈并产生保护力的一种好的组合。

??也有很少部分病人在出现了抗-HBs和抗-HBc以后，血清中或肝内可能还有少量病毒存在。这部分病人数量很少，可能仍有肝病的症状，肝功能仍有不同程度的异常，提示肝内仍有残余病变。对这部分病人仍要积极治疗，动态观察，可给一些抗病毒药如干扰素等，促进病毒的清除。这类病人是否仍有病毒存在，必须用高灵敏度的PCR方法检测HBV DNA，阳性时才能确诊。建议您在方便的时候，可到有条件的医院去做一下相关的检查。

第二：在此将医学教课书中关于乙肝五项（即乙肝两对半）的"大三阳"和"小三阳"及其防治等的相关知识给你介绍一下，仅供你参考。

乙肝五项及其意义：

表面抗原（HBsAg） 体内是否存在乙肝病毒

表面抗体（抗-HBs） 是否有保护性

е抗原（HBeAg）病毒是否复制及具有传染性

е抗体（抗-HBe） 病毒复制是否受

微量肉汤稀释法测MIC

一、试验原理目的

细菌在96孔板MH培养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀，很容易区别有无菌落生长，将抑菌剂依次对倍稀释，加入菌悬液培养一段时间后，无沉淀的最后一个空即为MIC浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度，且96孔板占地少，一板可做96个试验梯度，适用于大批量的检测试验，节约时间。 二、试验器材、化学试剂及菌种

96孔板、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。

菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌 三、试验准备 1、培养基的配置

MH培养基42g，蒸馏水1000ml。灭菌后待用，若一次用不完可放入4℃冰箱中放置。使用前拿出放置室温即可。 2、工器具的灭菌

将配置好的MH培养基、PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上。 2、抑菌剂的配置

第三章 抗原 一、名词解释 1．Ag

2．免疫原性 3．抗原性

4．抗原决定簇(表位) 5．构象决定簇 6．载体效应 7．共同抗原 8．交叉反应 9．TDAg

10．Forssman抗原 11．独特型抗原 12．SAg 13．佐剂

14．顺序决定簇 15．T细胞表位 16．B细胞表位 17.抗原结合价 18.异种抗原

19.外源性抗原 20.内源性抗原 21.可溶性抗原 22.T细胞表位

23.同种异型抗原 24.颗粒性抗原 25.TI-Ag 二、单选题

1.下列可诱导抗体产生的物质是( ) A. 完全抗原 B. 耐受原 C. 半抗原

D. 小分子化合物 E．人工合成佐剂

2.除了免疫原性以外，抗原的特性还有( A． 毒性

B． 变态反应原性 C． 抗原性 D． 异嗜性 E．耐受性

3.抗原分子中能与抗体结合的基因称为( A． 氨基酸 B． 免疫原 C． 吞噬体

) ) D． 表位

E． 互补决定区

4.来自另一物种的抗原性物质称为（ ） A．同种异型抗原 B.自身抗原 C.共同抗原 D．异嗜性抗原 E．异种抗原 5.半抗原是指( ) A． 既有免疫原性又有抗原性的物质 B． 大多数为蛋白质

C． 可刺

微量肉汤稀释法测MIC

一、试验原理目的

细菌在96孔板MH培养基中生长，过段时间由于量大会产生白色沉淀，很容易区别有无菌落生长，将抑菌剂依次对倍稀释，加入菌悬液培养一段时间后，无沉淀的最后一个空即为MIC浓度。本试验微量样品即可测出最小抑菌浓度，且96孔板占地少，一板可做96个试验梯度，适用于大批量的检测试验，节约时间。 二、试验器材、化学试剂及菌种

96孔板、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。

菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌 三、试验准备 1、培养基的配置

MH培养基42g，蒸馏水1000ml。灭菌后待用，若一次用不完可放入4℃冰箱中放置。使用前拿出放置室温即可。 2、工器具的灭菌

将配置好的MH培养基、PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上。 2、抑菌剂的配置

实验报告

学院：第二临床医学院 专业：临床医学 年级：2013级 班级：1班 姓名： 学号： 日期：2014,3,8 得分： 实验课程：生物化学实验

实验名称：蛋白质的定量测定（一）——紫外吸收测定

【实验目的】

了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 掌握紫外分光光度计的使用方法。 【实验原理】

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。

【实验器材与材料】

（一）试剂

1、标准蛋白溶液

牛血清蛋白预先经凯式定氮法测定蛋白氮

实验报告

学院：第二临床医学院 专业：临床医学 年级：2013级 班级：1班 姓名： 学号： 日期：2014,3,8 得分： 实验课程：生物化学实验

实验名称：蛋白质的定量测定（一）——紫外吸收测定

【实验目的】

了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 掌握紫外分光光度计的使用方法。 【实验原理】

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。

【实验器材与材料】

（一）试剂

1、标准蛋白溶液

牛血清蛋白预先经凯式定氮法测定蛋白氮

乙肝两对半定量检测的临床意义

血清乙肝标志物（两对半）定性测定始于80年代中期，对乙肝的疾病诊断、病程监测、疗效观察起到了一定的作用。随着临床医学的迅速发展，定性检测已远远不能满足临床及患者的要求。由于受检测抗原抗体定性结果不是“阳性”就是“阴性”，无法动态观察病情和疗效的变化，所以，为临床所能提供的信息有限。随着检验医学的发展，\两对半\定量测定成为可行，大大弥补了酶标（ELISA）定性检测的不足。同时，两对半的定量检测可与血清HBV－DNA荧光定量PCR测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效。 一、两对半定量检测极大的提高了检测的灵敏度。

化学发光免疫技术检测HbsAg灵敏度可达0.1ng/ml，而酶标（ELISA）检测HBsAg的灵敏度达到2ng/ml酶标才会呈阳性。

1、急性乙肝早期：定量能及早检出HBsAg，确证HBV感染，几乎能与preS1同时检测，在病程观察中大大缩短了\窗口期\时间，而酶标检测在乙肝早期检测往往HBsAg呈阴性。 2、慢性乙肝：一些患者由于机体常缺乏对HBV包膜蛋白的免疫应答，HBsAg表达较低，酶标检测可出现HBsAg和HbsAb均阴性的情况，而定量检测则可避免这些情况的出现,为正确判断病情提供依据。