pcr扩增的原理和应用

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pcr扩增实验报告

篇一：DNA提取及PCR扩增实验报告

PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳 1131428 环境科学 一、实验目的

1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。

2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。 二、实验原理 1. PCR扩增

多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）----------------精选公文范文----------------

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与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在T

反转录

概念

反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。

区分:反转录与逆转录不等同。反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。

2反转录酶与反转录过程

反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。

大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。

①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转

PCR仪的原理及其操作应用 §1. PCR仪的技术原理 §2. PCR仪的分类与应用 §3. PCR仪的操作步骤轻纺与食品学院 报告人：裴乐乐 指导老师：林教授

§1.PCR原理简介PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚 合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外 扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过 程 ，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成。

PCR原理示意图

PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC)Target Sequence

Target Sequence

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；

PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

②模板DNA与引物的退火(复性):模

PCR仪的原理及其操作应用 §1. PCR仪的技术原理 §2. PCR仪的分类与应用 §3. PCR仪的操作步骤轻纺与食品学院 报告人：裴乐乐 指导老师：林教授

§1.PCR原理简介PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚 合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外 扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过 程 ，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成。

PCR原理示意图

PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC)Target Sequence

Target Sequence

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；

PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

②模板DNA与引物的退火(复性):模

86 7

山西医科大学学报 ( hn i dUnv 08年 l JS ax i)2 0 Me 0月，3 (0 9 1

文章编号： 10—6 1 (0 8 1—0 7—0 0 7 6 12 0 )0 86 3

改良的降落 P R扩增中国地鼠目的基因 C宋国华一庞文彪 .,农业大学动物科技学院 )

张锐虎 刘田福 岳文斌 (山西医科大学实验动物中心，太原 000;山西，, 30 1

摘要：目的

优化 P R程序， C尝试用降落 P R扩增中国地鼠目的基因。方法 C

设计了 4对引物，用普通 P R和改良的 C降落 P R省略了常规 P R中摸索最适 C C

降落 P R扩增中国地鼠 C X1C X、 A H、 A 6部分基因。结果 C O、O 2 N D 5 N DH

普通 P R只有 1对引物扩增出特异性条带， C而

降落 P R 4引物都扩增出特异性条带， C对并与中国地鼠目的基因大小一致。结论 关键词：中国地鼠；降落 P R;退火温度； P R特异性 C C中图分类号： Q 8 71文献标识码： A

退火温度的过程，对中国地鼠一些 T值相近的基因可以使用降落 P R温度程序扩增， m C是一种行之有效的 P R方法。 C

M o fe o h wn P

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山西医科大学学报 ( hn i dUnv 08年 l JS ax i)2 0 Me 0月，3 (0 9 1

文章编号： 10—6 1 (0 8 1—0 7—0 0 7 6 12 0 )0 86 3

改良的降落 P R扩增中国地鼠目的基因 C宋国华一庞文彪 .,农业大学动物科技学院 )

张锐虎 刘田福 岳文斌 (山西医科大学实验动物中心，太原 000;山西，, 30 1

摘要：目的

优化 P R程序， C尝试用降落 P R扩增中国地鼠目的基因。方法 C

设计了 4对引物，用普通 P R和改良的 C降落 P R省略了常规 P R中摸索最适 C C

降落 P R扩增中国地鼠 C X1C X、 A H、 A 6部分基因。结果 C O、O 2 N D 5 N DH

普通 P R只有 1对引物扩增出特异性条带， C而

降落 P R 4引物都扩增出特异性条带， C对并与中国地鼠目的基因大小一致。结论 关键词：中国地鼠；降落 P R;退火温度； P R特异性 C C中图分类号： Q 8 71文献标识码： A

退火温度的过程，对中国地鼠一些 T值相近的基因可以使用降落 P R温度程序扩增， m C是一种行之有效的 P R方法。 C

M o fe o h wn P

消灭PCR非特异性扩增的黄金方法 by 老谈

2014-07-17 解螺旋

PCR技术作为实验室的入门级技术，却经常困扰各位实验大神们。虽然度过了初学者们少加漏加PCR体系的阶段，但很多奋战在实验室一线的小伙伴正遭遇着PCR非特异性扩增的尴尬事件。为了解决这个问题，有多少人曾经把退火温度从50℃试到70℃、重新合成过引物、换过模板、换过全新的电泳缓冲液，或者还带着满腔的愤怒捏碎过电泳胶？今天老谈来教教大家如何对非特异性扩增嗤之以鼻！

——by老谈

给各位小伙伴脑补一下非特异性扩增，即进行PCR所扩增出来的条带不是所要的，引物与模板在非目的条带处有错配，导致延伸产物不是目的条带。例如引物二聚体，即引物在退火过程中产生了hairpin结构或其他二级结构，或者引物在模板的某些位置非特异性地结合，也同样会产生非特异性扩增。

我们都知道，PCR产物都是通过引物延伸产生的。当引物产生了二聚体或者非特异性扩增产物之后，引物本身就无法再延伸形成PCR产物了，这样的情况下，非特异性扩增产物越是多，那目的产物就越是少。如果在qPCR过程中，就会在熔解曲线中形成双峰。

小伙伴们遇到这样的问题，首先想到的可能是加入DMSO来阻止引物二聚体形成，或者E

实时荧光定量PCR原理和实验 所属分类: 基因检测 更多见 www.infobio.org 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得

基本步骤：

1. 2. 3. 4. 5. 6.

收集拟扩增片段基因的基本信息；

样品扩增目的，与样品性质、数量、样品制作或处理方式，如制作标准曲线； 设计、合成、稀释与保存引物；收集扩增片段长度、扩增温度与时间条件； 普通PCR扩增条件的优化，凝胶电泳证实； 定量PCR条件的设计与标准曲线的制备；

溶解曲线、标准曲线等的判读与应用、标准曲线制备；

7. 改成相对定量测定，相对于内参基因以后的待测基因表达水平变化。

基础 1 X RXN （15 ul体系），除1 ul样标外的溶剂预混 Sense（10uM）: 0.5ul Antisense（10uM）: 0.5ul 2 X PCR mix (东洋纺，含SYBR)7.5ul

H2O (天根): 5.5ul

总体积： 14.0 ul

2 X PCR mix(东洋纺，含SYBR和ROX，产品号：QPK-201)。注释：ROX用于校正加样枪加样体积等（