植物总RNA提取

生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法

2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1. RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2. RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一) 仪器及器皿

1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅；

4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次

生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法

2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1. RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2. RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一) 仪器及器皿

1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅；

4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次

总RNA的提

实验九 总RNA的提取、定量与RT-PCR

一、总RNA的提取与定量

目的：

从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5 g RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离

。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是

E.Z.N.A. Total RNA Kit I (R6834-01 50 preps)

步骤

A． 真核细胞和组织

自己需要的材料：

β－巯基乙醇、70％乙醇（DEPC水配置）、除RNase的枪头和EP管。 材料的最佳量

想得到最佳的产量和好的Hibind RNA柱的纯化效果，选用正确的细胞和组织量是最重要的。Hibind RNA柱的最大处理量是可变的，根据细胞和组织的类型。最大的结合能力是100ug的RNA。TRK裂解缓冲液的最大裂解能力是1*107个细胞或30mg的组织。 细胞的步骤

1． 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞（≤1*107），使细胞团松散，轻轻弹EP管或者用

枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。

a) 使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β－巯基乙醇。 b) 如果是单层的组织培养细胞（成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在细胞培养器

里裂解细胞。完全吸去培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加700ul的TRK到T35细颈瓶或10cm的培养皿中，更小的培养器加500ul的TRK。将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至1.5mlEP管中。 c) 如果细胞是悬液培养，收集细胞（≤1,500rpm or

Trizol法提取总RNA

1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol试剂裂解；

②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；

2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；

3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；

4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；

5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清； 6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）； 7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀； 8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录； 9、进行反转录或分装保存于-80℃

南医实验报告

生物化学实验报告

姓 名：

学 号：

专业年级： 级临床八年制

组 别： 第二实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

南医实验报告

【预习报告】 一、 实验原理

1)总RNA的提取与定量

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是

哺乳动物组织样品RNA的抽提

哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

关键词：抽提 样品 哺乳动物组织 样品RNA

哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。 一、实验材料：

Trizol试剂（Invitrogen公司）

研钵，匀浆器，镊子，铝箔都高温灭菌即可； 二、具体过程：

1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中，若是比较大块的组织，要尽量把组织剪切成黄豆大小的块，使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。组织用铝箔包好或放入冻存管中，并做好记号，注意不要把记号写在纸上，以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。

2、在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300mg。

3、研磨到组织样品成粉末状后

1. 组织样品：称取 20mg-50mg 样品，使用液氮研磨或者匀浆器匀浆，加入 RNA-Solv ? Reagent裂解

2. 室温静置 2-3 分钟。

3. 加入 200μl 氯仿(氯仿的使用量为 1/5 RNA-Solv ? Reagent 的使用量） ，涡旋混匀 15 秒，冰浴 10 分钟。

4. 4℃，12,000×g 离心 15min。

5. 小心转移不大于 80%的水相层至新的离心管，加入 1/3 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀 15 秒。

6. 将 HiBind RNA 结合柱套在 2ml 离心管中， 转移不大于 700μl 混合液至 HiBind RNA 结合柱中。

室温下 10,000×g 离心 1 分钟，弃滤液。

7. 重复步骤六，直至所有的混合液全部离心，结合到 HiBind RNA 结合柱上。

8. 将 HiBind RNA 结合柱套在新的 2ml 离心管中， 加300μl RNA Wash Buffer I 至 HiBind RNA 结合柱中，10,000×g 离心 1 分钟，弃滤液； 9. （选做）DNase I 消化:

a. 配制 DNase I(Digestion Buffer, 73.5μl; RNase-Fr

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姓 名：

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专业年级： 级临床八年制

组 别： 第二实验室

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【预习报告】 一、 实验原理

1)总RNA的提取与定量

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是

总RNA提取（TRIzol法）

仪器和材料：氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（1000μL，200μL，

10μL）、移液枪、无RNA酶EP管（有1.5mL、2mL、15mL、50mL等不同规格）、75%乙醇（尽量现配现用，配制好后置于4℃冰箱待用）、滤纸、DEPC水、计时器记号笔等

注：上述材料标记好提RNA专用，自己保管好！

操作步骤：

1．细胞悬液按照每5×105~106个细胞加1mL TRIzol，贴壁细胞直接加TRIzol裂解，（1个T25cm2细胞培养瓶可加1~2mL TRIzol，可根据需求来添加），裂解数分钟（5~10分钟，可在倒置显微镜下观察细胞脱落情况），反复用枪吹打或持续振荡以裂解细胞。

2．将上述TRIzol裂解液转移至1.5mL EP管中，每个EP管做好标记，按照每1mL TRIzol加200μL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力振荡（手动）15秒，在室温下放置10~15分钟（观察到明显分层即可）；然后4℃离心机12000rpm离心15分钟。

3．将离心后EP管内上层液体转入新的EP管内（离心后分为3层，注意吸取第一层水相时不要吸到第二层，一般可吸到500μL左右），按照每1mL TRIzol加500μL异丙