MTT法检测细胞活性

MTT法活性筛选步骤

材料 试剂：

二甲亚砜（DMSO）分析纯 灭菌PBS, pH 7.4

MTT储存液（5mg/mL）：配制于灭菌PBS，-20摄氏度保存 工作液MTT：储存液用灭菌PBS稀释5倍使用。

MTT法筛选步骤 一、接种细胞

1. 将培养在100mm培养皿的对数生长期细胞去掉培养基，用5ml灭菌PBS洗涤一次 2. 去掉PBS，用胰酶消化制成单细胞悬液

3. 用血球计数板计数细胞悬液浓度，根据需要接种细胞量，吸取相应体积细胞悬液，用

培养液稀释至相应体积，混匀，使细胞浓度为5×104/ml.

4. 向96孔细胞培养板中每孔加入100ul细胞稀释悬液，空白组加入等量培养液，未加细

胞悬液的孔加入等量PBS缓冲液。 5. 培养板放入37℃，5% CO2培养箱中培养24h。

接种前的细胞必须状态良好，且不能太密集。否则不能接种。

接种时要不时摇晃细胞悬液，保证接种密度均匀。接种密度不均匀是造成误差的主要原因。

二、药物准备、药物处理

实验前开紫外照射细胞间、超净台及配药用离心管。 1. 待测样品用DMSO配成浓度为50mg/ml母液。

2. 用培养液将配好的50mg/ml母液稀释至100ug/ml，再用100ug/ml药物稀释成不同浓

度（

MTT法绘制生长曲线

一 细胞生长曲线：

A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料

（一）仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃、-20℃）

5. 倒置相差显微镜

6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）

（二）玻璃器皿

1. 吸管（弯头）

2. 培养瓶

3. 玻璃瓶（250ml、100ml）

4. 废液缸

（三）塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 24培养板

4. 胶塞

（四）其他物品

1. 微量加样枪

2. 红血球计数板

（五）试剂

1. D-Hanks液

2. 小牛血清

3. RPMI1640

4. 双抗（青霉素、链霉素）

5. 0.08%胰酶

（四）、操作步骤

1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；

2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要

MTT法绘制生长曲线

一 细胞生长曲线：

A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料

（一）仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃、-20℃）

5. 倒置相差显微镜

6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）

（二）玻璃器皿

1. 吸管（弯头）

2. 培养瓶

3. 玻璃瓶（250ml、100ml）

4. 废液缸

（三）塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 24培养板

4. 胶塞

（四）其他物品

1. 微量加样枪

2. 红血球计数板

（五）试剂

1. D-Hanks液

2. 小牛血清

3. RPMI1640

4. 双抗（青霉素、链霉素）

5. 0.08%胰酶

（四）、操作步骤

1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；

2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要

细胞增殖检测：MTT实验经验总结

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞

同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色

培养3－

一、淋巴细胞转化试验（MTT）

（一）原理：

四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。

（二）材料：

MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原

（三）方法： 1、脾细胞制备：

（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；

（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；

（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；

（4）制备脾细胞悬液

①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用

MTT：

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉

语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，简称：四唑盐。商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

原理：

MTT产品为淡黄色粉末，易被水溶解和透过细胞膜而进入细胞内，被活细胞线粒体脱氢酶还原形成不溶于水的蓝紫色甲臢结晶并沉积于细胞中，死细胞和红细胞无这种能力。结晶物形成的量与细胞数量和代谢活性成比例，因此吸光度A值大小可以反映细胞数量和活性。 在细胞MTT法测定过程中，细胞还原MTT所形成的甲臢培养物不溶于细胞液，需加入有机溶剂使细胞裂解，甲臢颗粒溶解便于比色。

应用：

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

评价：

优点：特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

方法：

①制备靶细胞（适宜浓度）。②加入待测的细胞因子或化学药物，37 ℃、5

　　　　天然产物研究与开发　　　　　　Vol.11　No.3N ATURAL PRODU CT RESEARCH AND DEVE LO PM EN T 　　　　　　　　　　　　

　　收稿日期:1999-01-07抗肿瘤药物筛选中M T T 法和SRB 法的比较

谭卫东　金　红　罗弟祥　钟绍东　苏　芝　彭旭东　高小平

(中国科学院成都地奥制药公司　成都　610041)

摘　要　在抗肿瘤药物的体外筛选中,M T T 法和SRB 法是常用的两种方法。我们用

M T T 法和SRB 法分别测定3种已知植物抗癌药对22株人肿瘤细胞的抗癌活性,对这

两种方法进行了详细的比较。通过分析两种方法测出的细胞存活率(T /C)的差异分布

和相关系数以及IC 50的二变量分布,比较了两种方法测定结果的异同;通过两种方法重

复测定3种药物对7株人癌细胞的抗癌活性,比较了两种方法的重复性;通过分析两种

方法测定结果T /C 值随时间变化的程度,比较了两种方法测定结果的稳定性。实验结

果表明:M T T 法和SRB 法的相关性较好,都可用于抗肿瘤药物的体外筛选,SRB 法更

适合于大规模筛选,3种抗癌药物的测定结果与临床资料基本一致。

关键词　M T T 法,SRB 法,抗肿瘤药物体外筛选抗

轴承灵活性自动检测系统的研发可行

性报告

一、 立项的背景和意义

国内目前具有一定规模的轴承生产企业与有2000家，除了少数大型合资企业的加工检测水平正在向国外先进轴承企业看齐外，大部分企业的加工检测水平还相当落后，特别是在产品检测，工艺控制技术方面，基本仍停留在采用传统的手工和半自动机械仪器，人工判断被测件的合格与否，这种方法测量精度低，受人的影响因数较大，判断风险高。随着科学技术的发展，轴承行业对全自动加工机床，自动轴承生产线与装配自动线的广泛使用，使轴承加工质量和效率大大提高，从而对检测技术、质量管理和统计工作提出了更高的要求。其中轴承灵活性检测是产品合格检验中重要的一环，要求实现100%检测，检测速度要符合技术要求，检测数据的处理、检测过程的分析和大容量数据存储查询功能。为此，研发一种自动检测系统是十分必要，能实现自动在线定位，自动检测功能，具备数据自动采集、处理、分析和存储查询功能的全自动检测系统。该系统符合当前我国轴承行业发展的趋势要求，也符合CSC追求生产全自动华和高品质产品的需求。研发成功后将大幅度提高检测的效率和精度，减小劳动力和劳动强度，减少人为失误，提高产品合格率和产品品质。

二、 灵活性检测的必要性

轴承的灵活性检测轴承

在园中看了很多帖子，在网上也查了很多帖子，但是都没有详细介绍如何用SPSS处理MTT结果的详细步骤（大家都是轻描淡写，也没有教详细的步骤），经过自己查阅书籍将具体的

方法总结如下，方便各位战友的学习。希望版主能加分！！！

SPSS处理MTT结果的方法及步骤

一、如下表所示：我们需要计算出某一浓度下某个时间点的细胞抑制率，并对计算出的数据进行统计学处理，比较（1）：同一浓度下不同时间点的细胞抑制率是否有统计学差异；（2）：相同时间不同浓度下的细胞抑制率是否有统计学差异；

不同浓度某药物作用下某种细胞株的生长抑制率 (`x±SD )( % ) ( n=3 )

浓度(?mol/L) 24h 48h 72h 200 150 100 50 25 12.5

1、选择统计学方法

单因素方差分析

2、处理原始数据

图中抑制率1、抑制率2、抑制率3分别代表重复三次的实验数据。

将上述原始数据分别变成下列形式以利于SPSS中的计算

3、打开SPSS输入数据（以下以同一浓度不同时间为例做示范）

4、修改变量视图

5、设定值

在园中看了很多帖子，在网上也查了很多帖子，但是都没有详细介绍如何用SPSS处理MTT结果的详细步骤（大家都是轻描淡写，也没有教

序批式活性污泥法（SBR）计算机辅助设计

从目前的污水好氧生物处理的研究、应用及发展趋势来看，序批式活性污泥法能称得上是一种简易、快速且低耗的污水处理工艺，非常适用于水质水量变化大的中小城镇的生活污水处理，以及易生物降解的工业废水处理。因此，SBR工艺是一种适合我国国情的处理工艺，具有很大的发展潜力和应用前景。

近年来，计算机辅助设计（CAD）已渗透到水处理专业，并被专业人员接受和使用。但目前建筑给排水CAD软件应用广泛，污水处理工程设计CAD系统则研究较少。SBR艺计算机辅助设计系统的开发，不仅能够提高设计效率及设计质量，也是计算机技术同污水处理技术有机结合的积极实践，对促进当前污水处理工程CAD的进一步发展具有积极的意义。 １ SBR工艺设计计算

SBR工艺设计计算包括SBR反应池容积的确定以及需氧量、污泥量的计算。

SBR工艺设计方法主要分两大类：经验设计法。动力学模式设计法[1]。经验设计法指污泥负荷率法，污泥负荷率是影响曝气反应时间的主要参数，污泥负荷率的大小关系到SBR反应池容积的大小。这种方法在目前的工程设计中应用较广泛。动力学模式设计法则是根据进水、出水和SBR系统的各种参数条件，建立数学模型后进行设计。由