细胞冻存与复苏的基本原则是快冻慢融

细胞冻存与复苏

细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存 【用品】

（1） 5%胰蛋白酶

（2） 含10%~20%血清培养液

（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒） （4） 吸管、离心管、冻存管 【步骤】

（1） 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。

（2） 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3） 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。

（4） 装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。

细胞的冻存

细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存！！！ 一 材料：

生长良好之培养细胞，新鲜培养基，DMSO，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片。

二步骤：

2.1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形，最好细胞应该处于对数生长期。 2.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5–10％，混合均匀，置于室温下待用。避免因临时配制产热而伤害细胞。

2.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1 mL)计数细胞浓度。

2.4. 先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。

2.5 接着置于–20℃冰箱，约30–60min。20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入–80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 2.6. 置于–80超低温冰箱中放置过夜。 2.7. 置于液氮罐中长期保存。

2.8 同时做好冻存记录，在自己的笔

甘油、DMSO细胞冻存液冻存效果的比较实验研究

【摘 要】目的采用两种不同的细胞冻存液对Vero细胞的冻存效果进行研究。方法 本实验主要研究甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂，以及他们与血清、基础培养基的不同配比与细胞冻存效果之间的关系。 结果发现不同的细胞冻存液在一定的所占比例内与细胞复苏后的成活率有一定的相关性，即在一定比例的冷冻剂保护下，细胞冻存的效果才会达到最佳。结论保护剂，无论是DMSO，还是甘油，其比例只有在10%-15%之间，细胞复苏后的成活率才达到最佳状态，即有利于细胞的冻存。且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。

【关键词】DMSO；甘油；Vero细胞；细胞冻存

细胞培养是研究活组织和活细胞的良好方法。长期传代势必会影响细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，也会造成资源浪费[1]。目前最常用的细胞冻存剂是DMSO和甘油，因此本实验主要研究这两种冷冻保护剂对细胞冻存效果的比较。本研究以DMEM为细胞培养液， 以DMSO或甘油作为冷冻保护剂，并添加胎牛血清组成冷冻保护液[2-3]，通过两种冻存液的不同配方及其不同配比对细胞冻存效果的比较采取最佳冷冻保护剂的比例将细胞冻存，为以后的工作提供更多便利，同时也节省了大

常用字生物标本处理办法

一般的生物标本包括有：

血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等

一般为无菌操作，低温保存（-80℃、液氮）

一．如果采集的实质器官则要求： 1、 器官实质不能太小

2、 以采集实质性病灶区为佳：如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的

地方为佳

3、 同一病例装入同一容器，并做好标记 4、 应在0-8℃的低温储存和运输 5、 实质性器官的处理：

5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨 5.2、加入约500ml的PBS/生理盐水，充分混匀 5.3、离心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作为待检标本（切勿反复冻融）

二．体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式

1、血液包括血浆和血清，它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样

1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸眼和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；

1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或4℃静置半小时后，800-10

常用字生物标本处理办法

一般的生物标本包括有：

血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等

一般为无菌操作，低温保存（-80℃、液氮）

一．如果采集的实质器官则要求： 1、 器官实质不能太小

2、 以采集实质性病灶区为佳：如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的

地方为佳

3、 同一病例装入同一容器，并做好标记 4、 应在0-8℃的低温储存和运输 5、 实质性器官的处理：

5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨 5.2、加入约500ml的PBS/生理盐水，充分混匀 5.3、离心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作为待检标本（切勿反复冻融）

二．体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式

1、血液包括血浆和血清，它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样

1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸眼和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；

1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或4℃静置半小时后，800-10

保险基本原则

学习目的与重点 [学习目的]

通过本课程的学习，主要使学员对保险的基本原则有所认识，尤其是掌握保险利益原则、最大诚信原则、近因原则、补偿原则、代位原则、分摊原则的含义。熟悉并了解这些原则的适用范围及其应用。

[学习重点]

1．保险利益原则的含义与确立条件 2．最大诚信原则的含义与内容 3．损失补偿原则的含义与范围

4．代位原则及行使代位求偿权的前提条件 5．重复保险情况下的分摊方法 6．近因原则及应用

第一节 保险利益原则

一、保险利益原则的含义 （一）保险利益及其确立 1．保险利益的含义

保险利益，是指投保人对投保标的所具有的法律上承认的利益。它体现了投保人或被保险人与保险标的之间存在的利害关系，倘若保险标的安全，投保人可以从中获益；倘若保险标的受损，被保险人必然会蒙受经济损失。

2．保险利益确立的条件

确认某一项利益是否构成保险利益必须具备三个条件： （1）必须是法律认可的利益。

保险利益必须是被法律认可并受到法律保护的利益，它必须符合法律规定，与社会公共利益相一致。它产生于国家制定的相关法律或法规以及法律所承认的有效

1

合同。凡是违法或损害社会公共利益而产生的利益都是非法利益，不能作为保险利益。

（2）必须是客观存在的

PLC编程的基本原则

PLC编程应该遵循以下基本原则。

1) 外部输入、输出继电器、内部继电器、定时器、计数器等器件的接点可多次重复使用，无需用复杂的程序结构来减少接点的使用次数。

2) 梯形图每一行都是从左母线开始，线圈接在最右边，接点不能放在线圈的右边参看图4-20。

图4-20 规则2）的说明

a）不正确电路 b）正确电路

3) 线圈不能直接与左母线相连。如果需要，可以通过一个没有使用的内部继电器的常闭接点或者特殊内部继电器R9010（常0N）的常开接点来连接，参看图4-21。

图4-21 规则3）的说明 a)不正确的电路 b）正确的电路

4) 同一编号的线圈在一个程序中使用两次称为双线圈输出。双线圈输出容易引起误操作，应尽量避免线圈重复使用。

5) 梯形图程序必须符合顺序执行的原则，即从左到右，从上到下地执行，如不符合顺序执行的电路不能直接编程，例如图4-22所示的桥式电路就不能直接编程。

图4-22桥式电路

6) 在梯形图中串联接点、并联接点的使用次数没有限制，可无限次地使用，如图4-23所示。

舞台的类型

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镜框式舞台:镜框式舞台是指观众位于舞台的一侧，而舞台的其余侧面被物体遮挡，以供演员和技术人员做准备工作。

伸展式舞台:伸展式舞台与镜框式舞台的区别在于，舞台的一部分向前突出，伸向观众席，这一部分的三面都暴露给观众。

圆环型舞台:圆环形舞台是指观众位于舞台的四周。通常圆环形舞台位于剧场的中央。观众可以近距离地欣赏表演。

旋转型舞台:主要通过液压设备制造出旋转的效果，会出现升降，旋转等效果。

舞台设计的基本原则

( l ）台口区域

l ）台口区域的高度一般在7m 左右，但从发展来看有望到8 ～9m ，特别对于流行音乐和歌舞的演出来说，其台口设计的要求比传统的演出高。尽端式舞台无法形成舞台口，它与观众席连成一体。

2 ）台口的宽度一般在16 ～18m 左右，18m 则已经是极限。这是受表演的限制，且演员在两台口近侧发声会产生回声感觉。传统做法是小型为10 ～12m ，中型为12～14m ，一般是观众厅宽的一半。为了适应现代的导演手法和剧情要求，可以增加台口外的副台。

3 ）台唇。伸出舞台框部分不小于1.5m 。 ( 2 ）舞台

l ）舞台宽为台口宽的两倍（28 ～32m ）。侧台应在舞台前部和表演区的一侧或两侧。

厂区绿化的基本原则

1.1 绿化应有自己的风格。

厂区绿化是以作业建筑为主体的环境净化、美化。要体现厂区绿化的特点与风格,充分发挥绿化的整体效果[2]。根据厂区的规模、行业特点,建筑物格局所处的环境,庭园使用的对象,布置的风格和竟境等因素,表现出新时代的精神风貌,衬托出厂区的敞朗、整齐、宏伟,使厂容厂貌格调高雅,面目鼎新。

1.2 厂区绿化应充分体现为生产服务和为工人服务。

厂区绿化使环境得以改善,有利生产,有利于工人身体健康。要充分了解工厂及其车间生产特点,使绿化适应性,实用性较为突出[2]。

1.3 合理布局,自成系统:要将园林绿化纳入工厂总平。

面布置中,做到全面规划、合理布局,形成点线面相结合,自成系统的绿化布局,从厂前区到生产区,从作业场到库房堆场,到处是绿树、青草、鲜花、充分发挥绿地的卫生防护美化环境的作用,使工厂掩映于绿茵之中[1]。

1.4 增加绿地面积,提高绿地率。

厂区绿化面积的大小,直接影响到绿化的功能。要多种途径,多种形式地增加绿地面积,以提高绿地率,绿视率[3]。厂区绿化是建设现代化工厂的重要组成部分，是消除污染、保护环境的重要措施。要搞好厂区绿化，必须根据工厂的建筑布局和土地的利用情况做出规划，采用点、线、面相结合的方法构成一个完

字体设计的基本原则

一个好的标志除拥有独特的图形外，拥有专属的字体设计也是非常重要的。很多企业在设计标志时往往忽略了这一点，以为随便用一个字库字体就OK了。但直接引用字库字体就会使得整个标志显得普通，还有可能引发字库版权官司，得不偿失。那如果设计优秀的字体，需要注意以下基本原则： 1．识别性、可读性：

文字的主要功能是在视觉传达中向大众传达企业的各种信息，要达到这一目的，我们必须考虑文字的诉求效果，表达清晰的视觉印象。因此，设计中的字体应避免繁杂零乱，使人易认，易懂，切忌为了设计而设计，忘记了其根本目的是为了更好，更有效的传达企业识别效果。 2．独特性，个性：

字体的设计要服从于标志整体的风格特征。字体的设计不能和整个标志风格特征相脱离，更不能相冲突，否则，就会破坏整体效果。一般说来字体的独特性或说个性大约可以分为以下几种：

端庄秀丽。这一类字体优美清新，格调高雅，华丽高贵。 坚固挺拔。字体造型富于力度，简洁爽朗，现代感强，有很强的视觉冲击力。

深沉厚重。字体造型规整，具有重量感，庄严雄伟，不可动摇。

欢快轻盈。字体生动活泼，跳跃明快，节奏感和韵律感都很强，给人一种生机盎然的感受。

苍劲古朴。这类字体朴