双缩脲试剂检测蛋白质注意事项

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白前期准备

（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。

（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。 （3）透析Buffer的选择可参考文献。

蛋白复性

包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。

包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。

如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。这里主要考虑第二种方案。

包涵体的洗涤

破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM

双缩脲法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制 管号 试剂 2mg/ml卵清蛋白液/ml 蒸馏水/ml 双缩脲试剂/ml 蛋白质浓度/(mg/ml) A 0 0.0 3.0 2.0 0.0 0.000 1 0.3 2.7 2.0 0.2 0.245 2 0.6 2.4 2.0 0.4 0.345 3 0.9 2.1 2.0 0.6 0.398 4 1.2 1.8 2.0 0.8 0.488 5 1.5 1.5 2.0 1.0 0.574

充分混匀，在540nm比色

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制 管号 试剂 标准蛋白液/ml 0.9% Nacl/ml 考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度/(微克/ml) A 0 0.0 1.0 4.0 0 0.000 1 0.1 0.9 4.0 10 0.009 2 0.2 0.8 4.0 20 0.041 3 0.3 0.7 4.0 30 0.077 4 0.4 0.6 4.0 40 0.083 5 0.6 0.4 4.0 50 0.123

充分混匀，在595nm比色

绘制 样液2样液2加3ml

卵清蛋白卵清蛋白加3ml

(A540nm)0.700

双缩尿法测定蛋白质浓度--标准曲线

A 线性

2.0 ? 0.927

2.

班级：________________ 姓名：________________ 学号：________________ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _装_ _ _ _ _订_ _ _ _ _线_ _ _（装订线内禁止填写答案）_ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____

一、单项选择题,（在备选答案中只有一个是正确的）(本大题共100小题,100分)

1. 维系蛋白质α-螺旋和β-折叠结构稳定的化学键是

A.氢键 B.离子键 C.二硫键 D.疏水作用 E.肽键

(4)氨基酸的疏水侧链很少埋在蛋白质分子的内部 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

11. 在电场中，蛋白质泳动速度取决于

A.蛋白质颗粒的大小 B.蛋白质颗粒的形状 C.带净电荷的多少

D.A+C

E.蛋白质所带电荷的多少，分子量的大小

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用

① FRET技术（in vivo）

FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：

以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。

②酵母双、三杂交技术（in vivo）

酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。

一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两

蛋白质和核酸检测题

《蛋白质和核酸》检测题

一、选择题(本题包括8个小题，每小题只有一个选项符合题意，每小题6分，共48分)。

1．生命起源的研究是世界性科技领域的一大课题，科学家模拟十亿年前地球的还原性大气环境进行紫外线辐射实验，认为生命起源的第一层次是产生了()

A．羧酸类B．糖类

C．醇类D．氨基酸

【解析】生命起源的第一层次是产生了氨基酸。

【答案】D

2．（原创）有关天然产物水解的叙述不正确的是()

A．油脂水解可得到丙三醇

B．可用碘检验淀粉水解是否完全

C．食物中的蛋白质在体内先水解生成氨基

【解析】核酸是通过一不定期方式结合而成的一类含磷的生物高分子化合物，可分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，但核酸不属于蛋白质，D项错误。

【答案】D

4．（原创）下列说法正确的是

( )

A．淀粉与纤维素的通式均为(C

6H

10

O

6

)n

B．人体内所有氨基酸均可以互相转化

C．葡萄糖、果糖的实验式不相同

D．L－多巴胺是一种有机物，其结构简式如下

它属于α－氨基酸，既具有酸性，又具有碱性

【解析】淀粉与纤维素通式均为(C 6H 10O 5)n ，A 错；部分氨基酸可以在人体内相互转化，但是有几种是在人体内不能合成的，必须从食物中获得，它们被称为必需氨基酸，B 错；葡萄糖、

第五章 蛋白质（Protein) 本章主要内容（Content）

蛋白质的一般性质（General aspects)

■ 结构 ■ 蛋白质-水相互作用，影响蛋白质水溶性的因素 ■ 蛋白质-脂的相互作用 蛋白质的变性（Denaturation）

■ 蛋白质变性产生的效应 ■ 导致蛋白质变性的物理因素 ■ 导致蛋白质变性的化学因素

蛋白质的功能性质（Functional Properties） 定义与分类

水化性质 溶解度与粘度、凝胶作用

组织化 热凝结和形成、纤维的形成热塑挤压、面团 乳化性质 乳化能力与乳化稳定性 起泡作用 起泡性与泡沫稳定性 ?蛋白质的营养特性（Nutritional properties） ?蛋白质的开发利用（Utilization）

植物蛋白质和动物蛋白质：浓缩蛋白质与分离蛋白质利用微生物生产蛋白质——单细胞蛋白 第一节 引言（Introducti

■ 蛋白质是构成生物体的基本物质。

病毒，细菌，激素，植物和动物细胞原生 质都是以蛋白质为基

1

础的。

■ 酶是蛋白质 已经发现数以千计的酶。 ■ 蛋白质是由20种氨基酸构成的聚合物 一、蛋白质的分类： （一）根据组成分类

? 简单蛋白质（

蛋白质 (Protein)

组成（Composition）

?生物大分子（Macromolecule） ?构件分子—氨基酸 (Amino acid)

氨基酸 (Amino acids) R—基团

对氨基酸性质影响强烈

?非极性、疏水性。 ?极性、电中性。

?极性、负电荷、碱性。 ?极性、正电荷、酸性。

水溶液中的氨基酸 两性电解质

水溶液中的氨基酸 酸性氨基酸

水溶液中的氨基酸 碱性氨基酸

分类（Classification）

?非极性、疏水性的 ?极性、电中性的

?极性、带负电荷、碱性的 ?极性、带正电荷、酸性的

?植物蛋白与动物蛋白在氨基酸组成上

的差异——

?人体必须氨基酸——

8种氨基酸

?蛋白质的生物学效价（PER） ?转基因植物蛋白

?各种氨基酸配比的蛋白食品

一级结构（Primary structure）

?氨基酸——氨基+羧酸基 ?肽键(Peptide bond)

一级结构（Primary structure）

?线性结构(Linear polymer of amino

acids) ?氨基酸序列（Sequence）——蛋白质分子

?氨基末端（N-terminal） ?羧酸基末端（C-terminal）

?氨基酸残基(Amin

1- 蛋白质化学

名词解释

（一） 两性离子（dipolarion）与两性化合物 （二） 等电点(isoelectric point,pI)与等离子点 （三） 必需氨基酸（essential amino acid） （四） 稀有氨基酸(rare amino acid)

（五） 非蛋白质氨基酸(nonprotein amino acid) （六） 构型(configuration)与构象(conformation) （七） 肽键、肽平面、肽单位、多肽 （八） N末端与C末端

（九） 蛋白质的一级结构(protein primary structure) （十） 蛋白质的二级结构(protein secondary structure) （十一） 蛋白质的α－螺旋结构 （十二） 蛋白质的β－折叠结构 （十三） 结构域(domain)

（十四） 超二级结构(super-secondary structure) （十五） 蛋白质的三级结构(protein tertiary

第十二章 蛋白质代谢

一：填空题

1.蛋白质的生物合成是以________________作为模板，________________作为运输氨基酸的工具，________________作为合成的场所。 2.细胞内多肽链合成的方向是从________________端到________________端，而阅读mRNA的方向是从________________端到________________端。

3.核糖体上能够结合tRNA的部位有________________部位、________________部位和________________部位。 4.ORF是指________________，已发现最小的ORF只编码________________个氨基酸。

5.蛋白质的生物合成通常以________________作为起始密码子，有时也以________________作为起始密码子，以________________、________________和________________作为终止密码子。

6.SD序列是指原核细胞mRNA的5′-端富含________________碱基的序列

蛋白质纯化

一．可溶性蛋白的纯化

方法 AC IEX GF 粗分离 + + - 中度纯化 + + - 精细纯化 - + + 1. 盐析

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。

2. 亲和纯化

Tag His GST MBP Strep(II) Flag

Size (aa) 6 218 396 8 8 Capacity (mg/ml) 40 10 10 6 0.6 MW (kDa) 1 26 42.5 1 1 Cleavage TEV/ Thrombin Thr