细胞冻存与复苏的基本过程

细胞冻存与复苏

细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存 【用品】

（1） 5%胰蛋白酶

（2） 含10%~20%血清培养液

（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒） （4） 吸管、离心管、冻存管 【步骤】

（1） 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。

（2） 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3） 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。

（4） 装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。

细胞的冻存

细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存！！！ 一 材料：

生长良好之培养细胞，新鲜培养基，DMSO，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片。

二步骤：

2.1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形，最好细胞应该处于对数生长期。 2.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5–10％，混合均匀，置于室温下待用。避免因临时配制产热而伤害细胞。

2.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1 mL)计数细胞浓度。

2.4. 先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。

2.5 接着置于–20℃冰箱，约30–60min。20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入–80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 2.6. 置于–80超低温冰箱中放置过夜。 2.7. 置于液氮罐中长期保存。

2.8 同时做好冻存记录，在自己的笔

甘油、DMSO细胞冻存液冻存效果的比较实验研究

【摘 要】目的采用两种不同的细胞冻存液对Vero细胞的冻存效果进行研究。方法 本实验主要研究甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂，以及他们与血清、基础培养基的不同配比与细胞冻存效果之间的关系。 结果发现不同的细胞冻存液在一定的所占比例内与细胞复苏后的成活率有一定的相关性，即在一定比例的冷冻剂保护下，细胞冻存的效果才会达到最佳。结论保护剂，无论是DMSO，还是甘油，其比例只有在10%-15%之间，细胞复苏后的成活率才达到最佳状态，即有利于细胞的冻存。且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。

【关键词】DMSO；甘油；Vero细胞；细胞冻存

细胞培养是研究活组织和活细胞的良好方法。长期传代势必会影响细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，也会造成资源浪费[1]。目前最常用的细胞冻存剂是DMSO和甘油，因此本实验主要研究这两种冷冻保护剂对细胞冻存效果的比较。本研究以DMEM为细胞培养液， 以DMSO或甘油作为冷冻保护剂，并添加胎牛血清组成冷冻保护液[2-3]，通过两种冻存液的不同配方及其不同配比对细胞冻存效果的比较采取最佳冷冻保护剂的比例将细胞冻存，为以后的工作提供更多便利，同时也节省了大

常用字生物标本处理办法

一般的生物标本包括有：

血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等

一般为无菌操作，低温保存（-80℃、液氮）

一．如果采集的实质器官则要求： 1、 器官实质不能太小

2、 以采集实质性病灶区为佳：如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的

地方为佳

3、 同一病例装入同一容器，并做好标记 4、 应在0-8℃的低温储存和运输 5、 实质性器官的处理：

5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨 5.2、加入约500ml的PBS/生理盐水，充分混匀 5.3、离心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作为待检标本（切勿反复冻融）

二．体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式

1、血液包括血浆和血清，它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样

1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸眼和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；

1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或4℃静置半小时后，800-10

围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结

实验一：细胞传代培养

材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10?S的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等

步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）

1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10?S的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。

2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。

3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。

4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。

5、弃上清液，加入少量10?S的1640培养基使成细胞悬液。

6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆

常用字生物标本处理办法

一般的生物标本包括有：

血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等

一般为无菌操作，低温保存（-80℃、液氮）

一．如果采集的实质器官则要求： 1、 器官实质不能太小

2、 以采集实质性病灶区为佳：如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的

地方为佳

3、 同一病例装入同一容器，并做好标记 4、 应在0-8℃的低温储存和运输 5、 实质性器官的处理：

5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨 5.2、加入约500ml的PBS/生理盐水，充分混匀 5.3、离心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作为待检标本（切勿反复冻融）

二．体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式

1、血液包括血浆和血清，它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样

1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸眼和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；

1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或4℃静置半小时后，800-10

细胞培养基及冻存液的配制

细胞培养基的配制： 注意事项：为了避免不小心污染造成的浪费，一般用50ml管分装配制。 配置比例：45ml 培养基（90%的总体积比例）+ 5ml FBS（血清，10%的总体积比例）+ 500μL 双抗（1:100的比例） 双抗：链霉素+青霉素——抑制细菌生长。

细胞冻存液的配制： 配置比例：5mlDMSO（100%纯度，以10%总体积的比例）+ 45ml已配好的培养基（90%的总体积比例）

注意事项：刚配好的细胞冻存液会发热，需用封口膜封住瓶盖后（防止细菌污染）放入冰箱冷冻后再使用。过热的冻存液会使得细胞死亡？？ 冻存液一般提前一天配好即可，放置太久会

DMSO二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide）：是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，因其抗冻作用，可用于细胞的冻存；

细胞冻存

操作步骤： 1、打开水浴锅，将培养基和冻存液用封口胶封好加热至37℃。

2、用酒精喷壶消毒（手及洁净工作台表面，进入工作台为防止污染均需酒精喷

壶消毒）；从培养箱中取出要冻存细胞的培养皿。

3、用移液管吸出培养基，弃至废液缸（注意移液管勿碰到废液缸壁或其他物品，

避免污染；移液管用完后倒

一．

二．

三． 实验名称：细胞的复苏 实验目的：将冻存的细胞恢复活性 实验原理：在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应

极其缓慢，甚至终止。所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

四． 实验步骤

一. 实验前准备：

1.将水浴锅预热至37℃，将培养液预热后分装到培养皿中

2.离心管、吸管、培养瓶等等。

二．取出冻存管：

1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

三．迅速解冻：

1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

四.平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min

五.制备细胞悬液：

1.吸弃上清液。

2.向离心管内加入10ml培养液，吹打

心肺复苏（CPR）基本操作

课程单元一

心肺复苏（CPR）的基本认知

1.CPR的概念 2.学习CPR的意义

CPR的概念

心肺复苏（CPR）是针对呼吸心跳停止的急症危重病人所采取的抢救关键措施。

扣紧“生命链”

“生命链”是指从“第一反应人”发现伤病员开始，到专业急救人员到达现场进行抢救的一个系列过程，它包括四个互相联系的环节序列，也叫链条，即“早期通路、早期徒手心肺复苏、早期心脏除颤、早期高级生命支持”。 +综合的心脏骤停后处理。

中美院前猝死存活率对比

在美国,有百分之八十以上的成年人会此技术, 其对院前猝死病人的救活率超过百分之四十.反观国内, 患者到医前的救活率只有百分之一点四.

学习CPR的意义

心肺复苏术(CPR)是现场急救的技术,如果在患者倒地后四分钟之内进行CPR；八分钟内做高级心脏救护术(ACLS)，则患者救活率高达43%。故应人人都必须有救死扶伤的人道主义精神，人人与急救有关，人人皆会CPR, 让许多危急的生命,以CPR抢救回来。

“时间就是生命”

抢救生命的黄金时间是4分钟，现场及时开展有效的抢救非常重要，我们每一个人都应该掌握心肺复苏技术。

课程单元二

心肺复苏(CPR)的操作要求

1.救护人员的要求 2.现

心肺复苏（CPR）时数 基本操作 新入职/一线员训练对象 工 1. 树立正确的现场救护观念。 课程目标 2. 激发学习现场救护知识、技能的兴趣 3. 掌握心肺复苏技能 课程内容 课程讲解 （抬头挺胸，精神饱满面带微笑上台，充满热情的向大家问好） 亲爱的新同事们，大家早上好！ 问安 自我介绍 单向演说 1分钟 大家好！我叫张军君，是公司的内部讲师，08年07月大学毕业后就加入福州空港急救中心，平时主要负责机场的医疗保障工作和公司的应急救护培训及急无 教学手法 教学时间 教具 撰表人： 2小时 课程名称 1

救常识的普及工作。 由于今天这节课的时间只有2小时，所以，我想先跟大家分享一些关于现场急救常识。因为时间的关系，今天只能讲一些观念性的东西。至于具体的基本急救知识、技能，比如“伤员转开场白 运”、“止血、包扎、固定”、双向问答 5分钟 “危重病现场急救”等，现在有学习渠道很多，相信大家可以只要想学，都有各种渠道可以学到。这些知识大家想去学，其实都不难。当然，如果大家有兴趣的话，也可以听我们急救中心的无 2

医生的相关的课程。不管是厦门的还是福州的，经常都有相关的、更丰富的课程。 首先，大家思考一个问题，生活中我们每个人都必须做的