pcr实验操作要点
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PCR试题要点
【A型题】 在五个选项中选出一个最符合题意的答案(最佳答案)。 1.以下哪种物质在PCR反应中不需要( )
A.Taq DNA聚合酶 B.dNTPs C.Mg2+ D.RNA酶 E.合适pH缓冲液 2.以下哪种酶可耐高温( )
A.Taq DNA聚合酶 B.Hind Ⅲ C.T4连接酶 D.RNA酶 E.Klenow片段
3.PCR反应正确过程应为( )
A.退火→变性→延伸 B.变性→退火→延伸 C.退火→延伸→变性 D.变性→延伸→退火 E.延伸→变性→退火 4. PCR技术的本质是( )
A. 核酸杂交技术 B. 核酸重组技术
C. 核酸扩增技术 D. 核酸变性技术 E. 核酸连接技术
5.Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为( )
A.37℃ B.50℃~55℃ C.70℃~75℃ D.80℃~85℃ E.94℃~95℃
6.温度均一性较好的PCR仪为( )
A.水浴锅PCR基因扩增仪和压缩机PCR基因扩增仪 B.半导体PCR基因扩增仪和离心式空气加热PCR基因扩增仪 C.压缩机PCR基因扩增仪和半导体PCR基因扩增仪 D.压缩机PCR基因扩增仪和离心式空气加热PCR基因扩增仪 E.水浴锅PCR基因扩增仪和离心式空气加热
PCR引物设计要点
PCR引物设计要点
1. 书写规则
设计引物时,5’端引物与目的序列正义链相同,而3’端引物则与目的序列正义链互补,书写时从引物的5’端至3’端(即5’端引物不变,3’端引物与目的序列互补并相反); 2. 引物长度
一般引物长度为18~30碱基(不包括5’端添加的修饰),引物太长和太短都不好; 3. GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%,不要有聚嘧啶或聚嘌呤,尤其3’端不应超过3个连续的G或C。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴,上下游引物的GC含量不能相差太大; 4. 退火温度
可以用软件PrimePrimer来计算退火温度,在引物短于20bp时,可以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5估计Tm值(解链温度),有效引物的Tm为55~65℃之间较好,如果待扩增基因的GC含量较高(超过50%),引物的退火温度可设计得高一点,例如接近65℃,因为提高退火温度可以降低非特异性扩增。一对引物的退火温度应尽量接近,相差范围应在5℃之内;
一般初次PCR使用的退火温度比计算出的解链温度低5℃,如果扩不出,可试着将退火温度降低5℃ 和升高5℃再试一下,但一般不要1℃ 1℃升,或1℃ 1℃
RT-PCR实验标准操作规程
一、实验名称:RT-PCR实验
二、实验目的:对提取的完整RNA进行体外转录,并应用PCR手段进行大量扩增,说明某种基因在体内的表达情况。
三、背景知识:RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外,这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术,更灵敏,更易于操作。
四、基本原理:RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA
RT-PCR实验标准操作规程
一、实验名称:RT-PCR实验
二、实验目的:对提取的完整RNA进行体外转录,并应用PCR手段进行大量扩增,说明某种基因在体内的表达情况。
三、背景知识:RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外,这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术,更灵敏,更易于操作。
四、基本原理:RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA
临床PCR实验攻略
临床PCR实验攻略
? 基础篇
一、如何选择试剂,评价试剂是否符合自己实验室条件?
现在临床PCR实验室使用的试剂大部分都是各生产企业提供的商品化的试剂盒,那么试剂质量的好坏直接决定了实验结果的好坏,而不同厂家试剂的性能、质量和价格千差万别,如何选择一款合适的试剂对每个PCR实验室都至关重要,一般来说,选择试剂主要从以下几个方面进行评价: 1、重复性
首先,试剂检测结果的重复性直接展现了试剂的方法学及其质量的好坏,是评价试剂好坏最明显、最直接的指标。
其次,我们在此说的试剂重复性是指对原始样本检测的重复性,而不是对某一个样本提取的核酸进行重复性的检测和评价。
最后,试剂的重复性对于疗效检测、用药指导有着重大的意义,一个重复性好的试剂,往往能够在病人的抗病毒治疗过程中,给医生和病人提供最直接、最可靠的数据,让医生和病人对疾病进展有更清楚的认识,从而制定合理的治疗方案,实现更好的治疗效果。 2、灵敏度
一个试剂的灵敏度往往能够体现该试剂的技术水平和先进程度,同时对于临床病症的监测有着举足轻重的意义。以乙肝为例来说,我国的乙肝复发率远远大于发达国家,同时由乙肝病毒感染转换为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列,这很大程度上与对低载量病毒监控的严
PCR 引物设计的原则和要点
PCR 引物设计的原则和要点
PCR 引物设计的原则和要点
http://www.77cn.com.cn 2005-5-13 9:13:57 来源:生物中国人
引物设计有3 条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点:
1 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
2 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加[2]。 3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4 引物序列的GC 含量一般为40-60
PCR 引物设计的原则和要点
PCR 引物设计的原则和要点
PCR 引物设计的原则和要点
http://www.77cn.com.cn 2005-5-13 9:13:57 来源:生物中国人
引物设计有3 条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点:
1 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
2 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加[2]。 3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4 引物序列的GC 含量一般为40-60
COD实验操作规程细节要点
COD测定细节注意事项
一、COD先期测定需要了解水样含量的步骤
1、 如果客户水样COD不超过1000mg/L,可以直接取2.5毫升,直接按照说明书的操作步
骤测定
例如:客户原水样5000mg/L,处理后不超过1000mg/L,可以直接操作(前提是要水样相对澄清,无悬浮物、泥土、渣滓等杂质,如果有这些可以静置一会,取中间悬清液)。 2、 如果客户水样COD超过1000mg/L,需要先稀释后,再按步骤操作实验。
例如:客户原水COD浓度比较高,为8000mg/L,需要先稀释10倍,取10毫升定容在100毫升的容量瓶中。然后测定稀释后的污水样,出来的结果乘稀释的倍数10。就是原水COD浓度。
3、 如果客户水样中COD超过1000mg/L,氯离子含量也大于1000mg/L,首先要保证氯离
子含量需要稀释到1000mg/L以下,进行操作实验。
例如:客户水样氯离子含量3000mg/L,COD含量COD含量1500mg/L。就需要稀释4倍或者5倍,氯离子对应的是750mg/L或600mg/L,进行操作。而不是稀释COD浓度2倍到750mg/L,而氯离子含量1500mg/L,测定结果中会浑浊,水样报废,稀释倍数不合适。
4、 如果客户水样COD不超过1
RT-PCR实验步骤
RT-PCR
注意:酶现拿现用,用完放回—20度
先配后加,节约枪头
试剂用前弹一下,再甩一下,再用;每次加液也是如此
一、DNase处理:
1、10ul 体系
Total RNA 1ug(或者2ug)A ul
10*buffer (含Mgcl2 )1ul
DNase(1U/ul)1ul
DEPC free water补足总体积10ul即为8-A ul
总体积:10ul
37℃,30分钟即DnaseⅠ
2、加入25mM的EDTA(终止DNA酶活性)1ul,(可以不加,无太大影响)
65℃,10min,即DnaseⅡ
备注:这一步后,共有11 ul的产物,取10ul进行一下的步骤,留取1ul作为对照,将这个1ul的留样用1ul的水稀释。
二、逆转录
(以下为20ul的体系,如果样品过多,或者不同体系可以等比加样)
1、加入,并混匀
1)总RNA(含有1-2ugRNA,或者是10ul的第一步中经过DNase处理的总RNA)
10ul
2)Primer oligo(dt)18 (0.5ug/uL)1ul
3)dNTP(10mM)1ul
总体积:12ul 65℃,5min,立即取出放置在冰上(保持开链状态)即程序cDNAⅠ
2、加入,并混匀
5 x first brand buffer 4ul
0.
pcr扩增实验报告
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pcr扩增实验报告
篇一:DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳 刘琳 1131428 环境科学 一、实验目的
1.学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2.对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验,并分析相应结果。 二、实验原理 1. PCR扩增
多聚酶链反应(PCR)技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液,加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸(dNTP)、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物,而后加热使模板DNA在高温下(94℃)变性,双链解链,这是所谓变性阶段。降低溶液温度,使合成引物在低温(55℃)----------------精选公文范文----------------
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与模板DNA互补退火形成部分双链,这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温(72℃),在T