t载体测序引物

常见载体的测序引物：

Primer of Vector:

Vector：Primer(F)；Primer(R)

pACT T7 T3

pACT2 GAL4 AD pACT2-R

pAS2-1 GAL4 BD pAS2-1.R

pB42AD pB42ADF pB42ADR

pBACPAK8 BAC1 BAC2

pBK-CMV T7 T3

PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7 T3/M13R

pBV220 PBV220F PBV220R

pCAMBIA 1301(1300) P1 P2

pCAMBIA 2300 M13R(-48) M13F(-47)

PCANTB5E S1/M13R S6

pCAT3-enhancer RVP3 此载体无反向引物

pcDNA3.0 CMV-F/T7 SP6/BGH

pcDNA3.1 T7 BGH

pcDNA4 T7/CMV-F BGH

pcDNA6 T7/CMV-F(J21025在T7前面） BGH

pcDNAII T7 SP6

pCE2.1 M13F M13R

pCEP4 pCEP-F EBV-R

pCF-T M13F M13R

pCI T7（17Base） 此载体无反向引物

pCI-neo T7（1

1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC CGGCCGCCAT GGCGGCCGCG 51 GGAATTCGAT* ATCACTAGTG AATTCGCGGC CGCCTGCAGG TCGACCATAT 101 GGGAGAGCTC CCAACGCGTT GGATGCATAG CTTGAGTATT CTATAGTGTC 151 ACCTAAATAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT 201 TGTTATCCGC TCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG 251 TAAAGCCTGG GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC 301 GCTCACTGCC CGCTTTCCAG TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA 351 TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT TTGCGTATTG GGCGCTCTTC 401 CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG

AFLP(扩增片段长度多态性)分子标记实验

扩增片段长度多态性Amplified fragment length polymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA 多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性

研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。

其基本原理是：以PCR(聚合酶链式反应)为基础，结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。

一、 实验材料

采用青稞叶片提取总DNA。

二、

测序常见峰图及原因说明

1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ 2. 什么是碱基缺失？ 3. 什么是引物不纯？

4. 重复结构对测序有哪些影响？ 5. 什么是模板不单一？

6. Poly结构的测序结果是怎样的？

7. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ 8. 测序峰图为前双峰的结果是什么样的？ 9. 测序峰图为后双峰是什么样的？

10. 无信号的结果：信号值(ATGC的平均值)皆小于100

11. 飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移 12. 没有任何干扰的结果

Q-1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ 返回顶端 A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大 小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是，高质量的 PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，希望您可以将PCR产物进行克隆处理，以确保得到好的测序结果。以下图为例： 该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。 查看大图

解决办法：改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该

转录组分析

研究背景：

RNA-Seq是通过结合实验和计算方法来鉴定生物样品中RNA序列的种类和丰度的一种技术。通过RNA-seq，我们就能够确定单链RNA分子中ATCG的顺序。整个过程主要包括：从细胞或组织中提取RNA分子、文库的构建以及后继的生物信息学数据分析。RNA-Seq技术具有许多早期研究方法（如：微阵列）所不具备的优点，如：RNA-Seq平台的高通量、新技术所带来的高灵敏度、发现新转录本、新基因模型以及非编码RNA的能力等。

RNA-Seq技术的到来，使人们认识到，无论是单细胞模式生物还是人类，我们对其转录组的认知异常匮乏。而RNA-Seq产生的新的数据，则可以帮助我们发现基因结构上的巨大差异、鉴定出新的转录本以及能够对small non-coding RNA和lncRNAs有着更好的了解。而且随着测序花费的降低，RNA-Seq的优势体现的更加明显。

服务流程：

样品选取

利用Oligo-dT富集mRNA

mRNA片段化

cDNA合成

末端修复、加polyA、加接头，PCR扩增

数据分析

测序方案：

内容：TotalRNA检测，普通转录组文库构建及测序及信息分析。 测序方式：H

高通量测序

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（\），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 名词解释

根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion

semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing

miRNA常用实验方法；一、miRNA的检测方法；miRNA的realtime-PCR检测方法；1、realtime-PCR引物设计；miRNArealtime-PCR引物设计方法：；1）stem-loopRT引物设计：基于通用的茎；GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG；2）realtime上游引物设计：miRNA序列；3）下游引物是通用的，序列miRNA常用实验方法

一、 miRNA的检测方法 miRNA的realtime-PCR检测方法 1、 realtime-PCR引物设计

miRNA realtime-PCR引物设计方法：

1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端

6

个碱基即可。通用茎环结构序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT 2）realtime 上游引物设计

使用oligo dT引物扩增的产物, 可以保证扩增产物包括mRNA的3'末端(减少rRNA的干扰), 但是oligo dT primer扩增有一个问题, 就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的问题, 之所以有长度这个问题,一方面和lz所提到的RNA完整性有关,但最重要的限制在于逆转录酶的延伸能力. 用oligo dT primer扩增可能出现扩增出来的片段长度短, 虽然都有mRNA的3'端, 但是序列信息多位于3'-UTR附近, 若扩增序列太短,则有用信息很少, 不利于序列的识别和分析.

使用random primer, 也有片段长度的限制, 但是由于它的逆转录并不一定在mRNA的末端起始, 而是在随机位置起始,所以它的扩增片段带有更多CDS的信息.但是如果是用总RNA逆转录的话,有可能会受到rRNA的干扰.

至于Gsp,只是在扩增已知gene/gene family以及部分原理的RACE中使用.

用随机引物时 要去除总RNA中的tRNA rRNA, 只保留mRNA

如果接下来你的PCR产物是外显子，就用oligo dT; 如果是内含子或者包括部分内含子，就用random

mRNA反转录之后的cDNA为模板进行PCR，不都是外显子吗

PCR 之引物设计--------基因序列查询篇 ?确定目标基因的形态：DNA or RNA ?查找目标基因

?比对目标基因同源性和特点 ?选取目标基因序列

?选取目标基因的目标区段

第一步：如何查基因：

1、mRNA 序列的查询； 以查大鼠cort为例；

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

search 选择 nucleotide for 1、rat cort 1、 在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA， Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对

象。

该mRNA文件的命名： Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA； NM_012835：是唯一的编号；

把以下序列存成ｔｘｔ文件：

Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA

* Comment * Features * Sequence

LOCUS NM_012835 438 bp mRNA linear ROD 11-FEB-2008 DEFINITION

高通量测序入门第一帖http://bbs.bioon.net/bbs/thread-368220-1-1.html 很高兴成为论坛特邀专家，鄙人会接下来的一段时间内写一些高通量测序数据方面的帖子，由浅入深，可能刚开始会比较简单一些，后面会有一些针对性的专题，也欢迎各位大侠或小菜提出建议或问题大家一起探讨。 为了活跃论坛建议大家直接跟帖或发新帖，我会尽快回复大家。

本人方向也仅限在RNA-seq 领域，所以其他领域的问题可能不太了解，只能按照自己的背景知识和请教别人解答，请大家慢拍砖！

另外，由于实验室课题比较忙，所以可能不能及时发帖或回复大家，也请见谅。

既然是入门专题，那就先简单说一下，要分析高通量测序数据的配置要求吧： 声明：该配置不适用与从华大拿回分析结果直接写paper 的同学。我认识的一位同学一点生物信息背景也没有，直接用华大返回分析结果发了很好的文章，如果想这样的同学可直接跳过这篇，等待以后的专题。 言归正传： 1. 软配置：

生物理论知识：熟悉生命活动的基本过程，对复制、转录、翻译、转录后修饰有较清晰的认识，如果知道cis-element 和 trans-factor 的区别就更好了。推荐朱玉贤的分子生物学，能够掌握60%