蛋白质和蛋白质相互作用的技术

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用

① FRET技术（in vivo）

FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：

以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。

②酵母双、三杂交技术（in vivo）

酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。

一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两

金属离子与血清白蛋白的相互作用

一、实验目的：

测定过渡金属离子对蛋白质功能的影响 二、实验原理：

金属离子在许多生命过程中发挥关键作用，研究金属离子与蛋白质的结合作用是生命科学的重要内容，是化学和生命科学研究的前沿领域。血清白蛋白是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众多的内源性和外源性物质。由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分离、提纯，从上世纪50年度（国内80年代末）开始，人们对血清白蛋白与金属离子（和药物分子等）的相互作用展开了大量研究，以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘。

许多蛋白质含有金属离子，金属离子对蛋白质发挥生物学功能起着关键性的作用。在人体基因组编码的蛋白质中，超过30%的蛋白质含有一个或多个金属离子；所有酶中，超过40%的蛋白质含有金属离子，它们在生命活动过程中发挥着各样的生物学功能。许多人类的疾病与金属离子-蛋白质的异常相互作用相关。

目前用于研究金属离子与蛋白质相互作用的研究方法主要有：（1）紫外-可

见吸收光谱法；（2）荧光光谱法；（3）平衡透析法；（4）毛细管电泳法；（5）电泳法等。

（一）紫外-可见光谱法

蛋白质通常有3个明显不同的紫外吸收带：（1）210n

蛋白质的相互作用

蛋白质间的相互作用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，互交叉形成网络，成细胞中一系列重要生理活动的基础。其中，多数蛋白质是通过与配体分子结合或者是作为1个大的生物复合体的一部分，与细胞完整性维持、遗传物质复制、基因表达调控、信号转导、免疫应答等一系列生命过程。研究蛋白质间相互作用的方式和程度，将有助于蛋白质功能的分析、疾病致病机理的阐明和治疗和新型药物的开发等众多难题的解决。因此，确定蛋白质间相互作用关系、绘制相互作用图谱已成为蛋白质组学研究的热点。近年来有许多方法被用于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交技术，免疫共沉淀技术，串联亲和纯化技术，化学交联技术，蛋白质芯片技术，荧光共振能量转移技术，噬菌体展示技术等。 酵母双杂交技术

Fields和song等首先在研究真核基因转录调控中建立起来的，是在真核细胞中检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用的方法。该系统是通过两个分别称之为“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”的融合蛋白形成一个完整的转录激活因子，从而激活报告基因的表达，通过在营养缺陷型培养基上生长或呈现显色反应来检测系统的功能。酵母双杂交系统可在全基因组规模上进行蛋白质一蛋白质相互作用高通量的研究。 免疫共沉淀技术

免疫共沉淀是利用抗原

金属离子与血清白蛋白的相互作用

一、实验目的：

测定过渡金属离子对蛋白质功能的影响 二、实验原理：

金属离子在许多生命过程中发挥关键作用，研究金属离子与蛋白质的结合作用是生命科学的重要内容，是化学和生命科学研究的前沿领域。血清白蛋白是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众多的内源性和外源性物质。由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分离、提纯，从上世纪50年度（国内80年代末）开始，人们对血清白蛋白与金属离子（和药物分子等）的相互作用展开了大量研究，以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘。

许多蛋白质含有金属离子，金属离子对蛋白质发挥生物学功能起着关键性的作用。在人体基因组编码的蛋白质中，超过30%的蛋白质含有一个或多个金属离子；所有酶中，超过40%的蛋白质含有金属离子，它们在生命活动过程中发挥着各样的生物学功能。许多人类的疾病与金属离子-蛋白质的异常相互作用相关。

目前用于研究金属离子与蛋白质相互作用的研究方法主要有：（1）紫外-可

见吸收光谱法；（2）荧光光谱法；（3）平衡透析法；（4）毛细管电泳法；（5）电泳法等。

（一）紫外-可见光谱法

蛋白质通常有3个明显不同的紫外吸收带：（1）210n

表面等离子体共振技术在蛋白质_蛋白质相互作用研究中的应用

第28卷第11期分析测试学报Vol128No111　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年11月FENXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)1344～1350综　述

表面等离子体共振技术在蛋白质-蛋白质

相互作用研究中的应用

杨　彦,戴　宗,邹小勇

(中山大学　化学与化学工程学院,广东　广州　510275)

摘　要:表面等离子共振(SPR)近年来迅速发展为用于分析生物分子相互作用的一项技术。该技术无需标

记、特异性强、灵敏度高、样品用量小,可实现在线连续实时检测。目前SPR已被广泛应用于免疫学、蛋白

质组学、药物筛选、细胞信号转导、受体/配体垂钓等领域。感器的基本原理和技术流程,综述了SPR在蛋白质-蛋白质相互作用动力学研究、、蛋白质突变和碎片分析、信号转导中的应用以及SPR。指

出SPR通过与光谱、电化学等多技术联用后,。

关键词:表面等离子体共振;蛋白质-;中图分类号:O629173;1::1004-4957(2009)11-1344-07

doi:101j111IProtein-ProteinInteractionsbySurfacePlasmo

个人收集整理 仅供参考学习

蛋白质间相互作用研究方法--技术流.txt吃吧吃吧不是罪，再胖的人也有权利去增肥！苗条背后其实是憔悴，爱你的人不会在乎你的腰围！尝尝阔别已久美食的滋味，就算撑死也是一种美！减肥最可怕的不是饥饿，而是你明明不饿但总觉得非得吃点什么才踏实。蛋白质间相互作用研究方法

确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质 .. 双杂交和其他双成分系统

第一阶段：诱饵-LexA融合蛋白的鉴定 诱饵-LexA融合蛋白的构建

1．将编码诱饵蛋白的靶DNA克隆到LexA融合载体的多聚接头处，以合成一种框架内的LexA 融合基因。确定诱饵序列的羧基端存在翻译终止序列。形成的质粒作为pBait。 2．采用下列LexA融合基因和lexAop-lacZ报道质粒的组合，建立一系列EGY48 lexAop-LEU2

个人收集整理 勿做商业用途 选择的转化酵母菌：

a. pBait + pMW12（活化测定）

b. pSH17-4 + pMW12（活化的阳性对照） c. pRFHM1 + pMW12（活化的阴性对照） d. pBait + pJK101（抑制/DNA结合测定） e. pRFHM1 + pJK101（抑制的阳性对照）

班级：________________ 姓名：________________ 学号：________________ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _装_ _ _ _ _订_ _ _ _ _线_ _ _（装订线内禁止填写答案）_ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____

一、单项选择题,（在备选答案中只有一个是正确的）(本大题共100小题,100分)

1. 维系蛋白质α-螺旋和β-折叠结构稳定的化学键是

A.氢键 B.离子键 C.二硫键 D.疏水作用 E.肽键

(4)氨基酸的疏水侧链很少埋在蛋白质分子的内部 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

11. 在电场中，蛋白质泳动速度取决于

A.蛋白质颗粒的大小 B.蛋白质颗粒的形状 C.带净电荷的多少

D.A+C

E.蛋白质所带电荷的多少，分子量的大小

第五章 蛋白质（Protein) 本章主要内容（Content）

蛋白质的一般性质（General aspects)

■ 结构 ■ 蛋白质-水相互作用，影响蛋白质水溶性的因素 ■ 蛋白质-脂的相互作用 蛋白质的变性（Denaturation）

■ 蛋白质变性产生的效应 ■ 导致蛋白质变性的物理因素 ■ 导致蛋白质变性的化学因素

蛋白质的功能性质（Functional Properties） 定义与分类

水化性质 溶解度与粘度、凝胶作用

组织化 热凝结和形成、纤维的形成热塑挤压、面团 乳化性质 乳化能力与乳化稳定性 起泡作用 起泡性与泡沫稳定性 ?蛋白质的营养特性（Nutritional properties） ?蛋白质的开发利用（Utilization）

植物蛋白质和动物蛋白质：浓缩蛋白质与分离蛋白质利用微生物生产蛋白质——单细胞蛋白 第一节 引言（Introducti

■ 蛋白质是构成生物体的基本物质。

病毒，细菌，激素，植物和动物细胞原生 质都是以蛋白质为基

1

础的。

■ 酶是蛋白质 已经发现数以千计的酶。 ■ 蛋白质是由20种氨基酸构成的聚合物 一、蛋白质的分类： （一）根据组成分类

? 简单蛋白质（

蛋白质 (Protein)

组成（Composition）

?生物大分子（Macromolecule） ?构件分子—氨基酸 (Amino acid)

氨基酸 (Amino acids) R—基团

对氨基酸性质影响强烈

?非极性、疏水性。 ?极性、电中性。

?极性、负电荷、碱性。 ?极性、正电荷、酸性。

水溶液中的氨基酸 两性电解质

水溶液中的氨基酸 酸性氨基酸

水溶液中的氨基酸 碱性氨基酸

分类（Classification）

?非极性、疏水性的 ?极性、电中性的

?极性、带负电荷、碱性的 ?极性、带正电荷、酸性的

?植物蛋白与动物蛋白在氨基酸组成上

的差异——

?人体必须氨基酸——

8种氨基酸

?蛋白质的生物学效价（PER） ?转基因植物蛋白

?各种氨基酸配比的蛋白食品

一级结构（Primary structure）

?氨基酸——氨基+羧酸基 ?肽键(Peptide bond)

一级结构（Primary structure）

?线性结构(Linear polymer of amino

acids) ?氨基酸序列（Sequence）——蛋白质分子

?氨基末端（N-terminal） ?羧酸基末端（C-terminal）

?氨基酸残基(Amin

（1）氨基酸、蛋白质的生理功能

蛋白质是人体必需的主要营养物质。蛋白质的分解产物是氨基酸；氨基酸的重要生理功能之一是作为蛋白质、多肽合成的原料，是蛋白质或多肽的基本组成单位。

蛋白质的生理功能：

①维持组织的生长、更新和修复：膳食中必须提供足够质和量的蛋白质，才能维持组织、细胞的生长、更新和修复。

②参与多种重要的生理功能：如催化功能、调节功能、运输功能、储存功能、保护功能和维持体液胶体渗透压（如清蛋白）等。

③氧化供能：体内蛋白质、多肽分解成氨基酸后，产生（17.19kJ/g）能量，成人每日约有18%的能量来自蛋白质。

④转变为糖类和脂肪。

（2）营养必需氨基酸的概念和种类

体内需要而不能自身合成、或合成量不能满足机体需要，必须由食物供应的氨基酸称为营养必需氨基酸。 营养必需氨基酸包括赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。

蛋白质的功能和对人体的作用

人体的所有组织器官都会有蛋白质，蛋白质是生命的物质基础。 蛋白质是人体的主要“建筑材料”。婴幼儿靠它形成肌肉、血液、骨骼、神经、毛发等； 成年人需要它更新组织，修补损伤、老化的机 体。没有蛋白质的供给，人就不可能从3～4千 克的新生儿长成50～60千克重的成年人，所以说蛋白质是人体