原核诱导表达菌液浓度ABS

原核诱导表达的标准操作程序（SOP） 一．目的：

使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。

二．适用范围：

本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。

三．实验原理：

E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录

原核诱导表达的标准操作程序（SOP） 一．目的：

使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。

二．适用范围：

本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。

三．实验原理：

E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录

[Merck推荐]原核表达秘笈之宿主菌株选择指南

在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。 事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因——即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。

作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？

知其然还要知其所以然。比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。

真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同

原核：（1）、要构建一个合适的原核表达载体的基本要求：

①有一个强的启动子及其两侧的调控序列； ②有SD序列及SD序列与起始密码子之间要有

合适的距离； ③在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架； ④外源基因下游加入不依赖ρ因子的转录终止区。（2）、编码基因要完整，没有插入序列；（3）、将真核基因克隆到原核基因中，以保证产物表达的稳定性；（4）、克隆基因中保留信号肽序列，使表达产物自细菌分泌到溶液中，有利于产物的分离纯化。 表达详细步骤

PartⅠ选择表达的目的基因

一、 基因序列

1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:

① 利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。

② 实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。 ③ 利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。 2. 注意事项：

①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和part

原核表达步骤

原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。

一． 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达 （一） 制样

1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL），37oC200r/min摇床培养，过夜活化。 2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37oC200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)

3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37oC摇床培养3h。

4. 以50

精品文档

。 1欢迎下载 对于全世界许多研究者， Novagen 的 pET 系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌 RNA 聚合酶识别的 T7 启动子之下，因此在加入 T7 RNA 聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到 pET 载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由 lacUV5 控制的 T7 RNA 聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入 IPTG 诱导表达；也可通过 l CE6 感染原始克隆宿主菌来提供 T7 RNA 聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统 ( 如 tac 、 lac 、 trc 、 pL) 有困难的许多基因已经在 pET 系统中稳定克隆和表达。 T7 RNA 聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小

时目标产物就可超过细胞总蛋白的 50% 。

新开发的 T7 驱动表达技术以 pETBlue TM 系统为代表。 pETBlue 载体包括了 pET 用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒 DNA 操作的方面更为方便。

pETBlue TM 系统：新一代 T7 表达载体

pETBlue 载体代表

u表达载体

u表达菌株

u表达条件

原核表达原理概述目的基因

表达载体构建

重组载体

转化

表达菌株

培养，诱导“基因——载体——菌株——

培养”

?启动子

?融合标签

?常用表达载体系统

常见启动子

?λpL启动子：热诱导启动子

? trp启动子：化学诱导启动子

? trc启动子：trp+lac杂交启动子

? tac启动子：trp+lac UV5杂交启动子；

pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB）

?T7/T7lac启动子：pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）

T7启动子

T7lac 启动子

?常用于蛋白检测与纯化。

?有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。

表达量高

提前终止会干扰纯化

二级翻译起始不影响纯化

基因不能自带终止密码子

提前终止不影响纯化

二级翻译起始会干扰纯化

? MBP·Tag pMal系统

常用表达载体系统系统名称公司启动子抗性常用标签特点pGEX GE

(Pharmacia)

tac Amp GST·T ag

pMal NEB tac Amp MBP·Tag

pET Merck

(Novagen)T7

T7lac

Amp

Kan

His·Tag

pEASY Transgen T7lac Amp His·Tag同pET系统

考虑因素细胞特性

蛋白稳定性

原核生物和真核生物基因表达调控、复制、转录、翻译特点的比较

1.相同点：转录起始是基因表达调控的关键环节

①结构基因均有调控序列；

②表达过程都具有复杂性，表现为多环节； ③表达的时空性，表现为不同发育阶段和不同组织器官上的表达的复杂性；

2.不同点:

①原核基因的表达调控主要包括转录和翻译水平。真核基因的表达调控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次。 ②原核基因表达调控主要为负调控，真核主要为正调控。 ③原核转录不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启动子,由sita因子决定基因表的的特异性，真核基因转录起始需要基础特异两类转录因子，依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用调控转录激活。 ④原核基因表达调控主要采用操纵子模型，转录出多顺反子RNA，实现协调调节；真核基因转录产物为单顺反子RNA，功能相关蛋白的协调表达机制更为复杂。 ⑤真核生物基因表达调控的环节主要在转录水平，其次是翻译水平。原核生物基因以操纵子的形式存在。转录水平调控涉及到启动子、sita因子与RNA聚合酶结合、阻遏蛋白、负调控、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等。翻译水平的调控涉及SD序列、mRNA的稳定性不稳定(5

原核生物和真核生物基因表达调控、复制、转录、翻译特点的比较

1.相同点：转录起始是基因表达调控的关键环节

①结构基因均有调控序列；

②表达过程都具有复杂性，表现为多环节； ③表达的时空性，表现为不同发育阶段和不同组织器官上的表达的复杂性；

2.不同点:

①原核基因的表达调控主要包括转录和翻译水平。真核基因的表达调控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次。 ②原核基因表达调控主要为负调控，真核主要为正调控。 ③原核转录不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启动子,由sita因子决定基因表的的特异性，真核基因转录起始需要基础特异两类转录因子，依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用调控转录激活。 ④原核基因表达调控主要采用操纵子模型，转录出多顺反子RNA，实现协调调节；真核基因转录产物为单顺反子RNA，功能相关蛋白的协调表达机制更为复杂。 ⑤真核生物基因表达调控的环节主要在转录水平，其次是翻译水平。原核生物基因以操纵子的形式存在。转录水平调控涉及到启动子、sita因子与RNA聚合酶结合、阻遏蛋白、负调控、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等。翻译水平的调控涉及SD序列、mRNA的稳定性不稳定(5

真核基因表达的调节 多级调节，特有长期调控。

（一）转录前调节：通过改变DNA序列和染色质结构而影响基因表达。1.染色质的丢失：某些低等真核生物在发育早期可丢失一半染色质，生殖细胞除外。红细胞成熟时细胞核丢失。2.基因扩增：细胞在短期内大量产生某一基因的拷贝。如发育时核糖体基因的扩增。3.染色体DNA序列重排：淋巴细胞成熟时抗体基因重排，可产生许多种抗体分子。4.DNA修饰和异染色质化：高等动物常用异染色质化的方法永久关闭不需要的基因。甲基化可改变染色质结构、DNA构象、稳定性及与蛋白质作用方式，非活性区甲基化程度高。去甲基化能诱导基因的重新活化。 （二）转录活性的调节：分两步，先活化，再与其他因素作用1.染色质的活化：使基因区呈疏松状态2.激素的诱导：固醇类激素进入细胞核，与非组蛋白作用，促进转录。3.增强子：与启动子位置无关，无方向性。

（三）转录后调节：加帽子和尾可延长寿命，选择性剪接、RNA编辑可产生不同的信使RNA。 （四）翻译水平调节：主要是控制稳定性和有选择地翻译。某些蛋白因子可起保护作用，翻译控制RNA可与之形成双链，抑制翻译。对eIF2的磷酸化也可抑制翻译。

（五）翻译后的调节：翻译后加工也有调控作用。不同的加工方式可产