CRISPR- CAS9

一、材料试剂准备

1） 质粒：

pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid ID: 48138)，用于转染cas9，该质粒含有Cas9与GFP，Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的ko，GFP可做为转染标签。

pSpCas9(BB) (Addgene plasmid ID: 42230)，若实验用sgRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。

pUC19(Invitrogen, cat.no.15364-011)可用于构建sgRNA，若用PCR产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNA carrier。

上述三种质粒，根据实验选择sgRNA的表达方式（PCR产物/ 单载体系统/ 双载体系统）来确定具体使用哪种。

2） 超纯水，DNase/RNase-free (Life Technologies, cat. no. 10977-023)

3） 高保真聚合酶，Kapa HiFi (Kapa Biosystems), PfuUltra (Agilen)，Herculase II fusion polymerase 均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。

4） Taq DNA

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程

未来的中国科学家们，加油！ Genloci Classic CRISPR-Cas9内

部操作流程

Protocol No. PT140726-1

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程

1，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：

1 ～20bp

-3’ - CACC G 5’

-5- CAAA ’ 3’

设计2条单链oligo序列；退 火形成双链DNA。

2 将双链 DNA连接到载体中。

3 转化 G10 Competent Cell；筛 选阳性克隆；测序验证序列； 质粒大提；电转染靶细胞。

4 在细胞内 crRNA识别靶位点， Cas9对靶位点进行随机剪切。

5

CruiserTM酶切细胞池，计算突变 率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆； 将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。

CRISPR/Cas9系统的发现历史和应用-@华夏凯奇

【CRISPR/Cas9系统的发现历史和应用-@华夏凯奇】

-兼谈八卦。水平有限，不准确和班门弄斧之处，还望大家斧正。

一、CRISPR系统的发现-从细菌的获得性免疫说起

CRISPR系统实际是细菌的一种获得性免疫系统。细菌被phage侵染之后，可以获得phage的DNA片段整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，从对phage形成免疫。

1） 早在1987年，日本人在大肠杆菌中发现有串联间隔重复序列。但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。2002年才正式命名为CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).

2） 随着测序技术和生物信息学的发展，2005年，三个研究组同时发现间隔序列（图中红

色箭头所示）和侵染细菌的病毒或phage高度同源。从而推测，这一系统可能是类似于siRNA一样，是细菌抵抗Phage的一种机理。

（这些和植物的siRNA, 高等动物的获得性免疫一样，都是获取入侵病毒的一个片段形成记忆，从而再次遭到入侵时可以对抗入侵的一种方式）

这中间还有很

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程

未来的中国科学家们，加油！ Genloci Classic CRISPR-Cas9内

部操作流程

Protocol No. PT140726-1

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程

1，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：

1 ～20bp

-3’ - CACC G 5’

-5- CAAA ’ 3’

设计2条单链oligo序列；退 火形成双链DNA。

2 将双链 DNA连接到载体中。

3 转化 G10 Competent Cell；筛 选阳性克隆；测序验证序列； 质粒大提；电转染靶细胞。

4 在细胞内 crRNA识别靶位点， Cas9对靶位点进行随机剪切。

5

CruiserTM酶切细胞池，计算突变 率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆； 将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。

植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (9): 1351~1358　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.01761351

综　述 ReviewsCRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物基因功能研究及植物改良中的应用

曾秀英1, 侯学文1,2,*

华南农业大学生命科学学院1植物逆境生物学研究中心; 2广东省植物功能基因组与生物技术重点实验室, 广州510642摘要: CRISPR/Cas是发现于细菌和古细菌基因组中的特殊结构, 参与细菌和古细菌破坏噬菌体和外源质粒的免疫保护。科学家将II型CRISPR/Cas改造成为一个组装简便、高效和精准的基因组编辑工具, 并迅速在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改造中获得广泛应用。本文介绍CRISPR/Cas9技术出现近两年来, 在水稻、小麦、高粱、拟南芥、烟草、甜橙等植物中的研究情况, 在此基础上对该技术的优点和需要进一步改进的地方提出了看法。

关键词: 成簇的、规律间隔的短回文重复序列; 成簇的、规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶9; 基因组编辑技术; 植物基因功能; 植物改良

Application of CRISPR/Cas9

Hereditas (Beijing) 2015年11月, 37(11): 1125―1136 www.chinagene.cn

综 述 CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估

谢胜松1，张懿2，张利生1，李广磊1，赵长志1，倪攀1，赵书红1

1. 华中农业大学，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070； 2. 中国人民解放军第161医院妇产科，武汉 430010

摘要： 基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术，已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种

的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点，而使用高效且特异的sgRNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。目前，已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计和/或脱靶效应评估软件，但不同的软件各有优缺点。本文重点对16款sgRNA 设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述，通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析，最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法，以及如何筛选高效且特异的sgRNA进行了归纳总结

CRISPR/Cas9-based genome editing technology

A robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of

genomic sites in monocot and dicot plants

亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室

华南农业大学生命科学学院

刘耀光课题组

(ygliu@scau.edu.cn)

1. pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍

CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guide RNA (sgRNA)以及由sgRNA引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs），TALENs更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。

我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。

本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点Bsa I位于靠近双元载体RB位置。sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和P

CRISPR/Cas9-based genome editing technology

A robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of

genomic sites in monocot and dicot plants

亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室

华南农业大学生命科学学院

刘耀光课题组

(ygliu@scau.edu.cn)

1. pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍

CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guide RNA (sgRNA)以及由sgRNA引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs），TALENs更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。

我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。

本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点Bsa I位于靠近双元载体RB位置。sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和P

CRISPR/Cas9-based genome editing technology

A robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting of

genomic sites in monocot and dicot plants

亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室

华南农业大学生命科学学院

刘耀光课题组

(ygliu@scau.edu.cn)

1. pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍

CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guide RNA (sgRNA)以及由sgRNA引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs），TALENs更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。

我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。

本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点Bsa I位于靠近双元载体RB位置。sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和P

最近几年基因编辑技术异常火爆，CRISPR/Cas9技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，使得基因的“任意编辑”变得越来越容易。也因此，CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”，大有一副取而代之的势头。所以这里就给大家简单介绍一下CRISPR/Cas9的技术原理！ 一、CRISPR/Cas9系统的构成

CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。

Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。 研究