原生质体培养和体细胞杂交

第九章 原生质体培养和体细胞杂交

本章大纲 9.1 原生质体的分离与纯化 9.2 原生质体培养 9.3 体细胞杂交

什么是植物原生质体？ 什么是植物原生质体？植物原生质体(protoplast)是去掉细胞壁的由质膜 是去掉细胞壁的由质膜包裹、 包裹、具有生活力的细胞 是植物细胞工程和许多理论研究的理想材料仍保持植物细胞的全能性 仍能进行植物细胞的各种生命活动

是植物遗传转化的理想受体膜较薄，易从外界摄入DNA、染色体、细胞器、 膜较薄，易从外界摄入DNA、染色体、细胞器、 DNA 细胞核、 细胞核、甚至 病毒颗粒等

原生质体

植物细胞

9.1 原生质体的分离与纯化9.1.1.1 材料的选择几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体 几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体 每一部分 叶片、愈伤组织、悬浮培养的细胞都可制备原生质体 叶片、愈伤组织、 叶片是最常用的材料 叶片是最常用的材料 一般选用结构疏松并处于对数生长期 结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系 一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系 分离原生质体效果较好 一般选用生长旺盛 生命力强的组织作为分离原生质 生长旺盛、 一般选用生长旺盛、生命力强的组织作为分离原生质 体的材

实验九 植物原生质体的分离和培养

实 验 目 的

掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。

实 验 原 理

原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。

植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。

分离愿生厦籀萨采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。

实 验 用 品

一、材料

1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。 2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。

二、器材

超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养

第2课时 植物体细胞杂交技术

一、教学目标： 1、知识目标：

（1）分析植物体细胞杂交技术的基本原理； （2）描述植物体细胞杂交技术的基本过程； （3）说出植物体细胞杂交的实践意义和局限性；

2、能力目标：培养和提高自己的语言表述能力和设计能力。 3、情感目标：树立热爱科学、勇于想象、敢于创新的意识。 二、教学重难点：

1、教学重点：植物体细胞杂交技术的操作流程。 2、教学难点：表述能力和设计能力的培养。 三、课时安排： 1课时

四、教学内容安排： （一）温故知新

同学们，大家好！在学习今天的新课之前，让我们来回顾一下上节内容。请大家看这幅图（幻灯片放映），这是我们之前学过的生物学技术：植物组织培养！（学生齐声答）有没有同学帮大家梳理有关内容？（指定一名学生作答，对不完整的叙述进行提问补充）

1、取胡萝卜韧皮部组织称之为？外植体！外植体的概念？离体的植物器官、组织、细胞或原生质体等可以进行植物组织培养的材料统称为外植体。

2、将植物组织分散成单个植物细胞用什么处理？果胶酶！为什么？细胞壁成分是纤维素和果胶，纤维素构成植物细胞壁的骨架，果胶具有黏合作用。

3、什么是脱分化？又称去分化，已分化的植物细胞形成愈伤组织的过程。

原生质体制备方法

培养基：

① PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水

② MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、PH6.5

③ MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、0.5mol蔗糖、1L

水、PH6.5

④ MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、0.5mol

蔗糖、PH6.5

试剂：

① 1mol/L MgSO4 ② 0.5mol/L MgSO4

③ STC：0.8M 山梨醇、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ④ 肝素

⑤ SPTC：0.8M 山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ⑥ 无菌水

操作步骤：

① 倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days

② 用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG

液体培养基中，120rmp，28℃，12h

③ 以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h ④ 混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤

植物细胞工程的基本技术 教学设计

宝鸡石油中学 翟绍军 2010.5

一 教学目标：

1.知识和能力目标 ：

⑴知道植物组织培养和植物体细胞杂交技术的基本原理 ⑵描述植物组织培养和植物体细胞杂交技术的基本过程 ⑶说出植物体细胞杂交的理论和实践意义 （4）培养和提高学生的语言表述能力和设计能力。

2.情感目标：树立学生热爱科学、勇于想象、敢于创新的意识。

二 教学重点难点

1.教学重点：（1）植物组织培养的原理和过程。

（2）植物体细胞杂交技术

2.教学难点：植物组织培养的实验和表述能力和设计能力的培养。

三 课时：1课时

四 教学方法：诱导启发；阅读思考；讨论交流。 五 教具准备：多媒体课件 六 教学过程：

【提问】为什么植物的一个花瓣就可以培育出完整的植株呢？ 【引出问题】：细胞的全能性和分化。

【问题】怎样把植物的一个花瓣培育成完整的植株？ 引入课题: 植物组织培养技术

[板书] 〖温故知新〗

【布置阅读，回答问题】

1.植物组织培养的基本原理是什么？（细胞具有全能性） 细胞具有全能性:

具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能，也就是说，每个生物细胞都具有全能型的特点。

因此，在理论上生物体的任何

原生质体制备方法

培养基：

① PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水

② MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、PH6.5

③ MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、0.5mol蔗糖、1L

水、PH6.5

④ MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、0.5mol

蔗糖、PH6.5

试剂：

① 1mol/L MgSO4 ② 0.5mol/L MgSO4

③ STC：0.8M 山梨醇、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ④ 肝素

⑤ SPTC：0.8M 山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ⑥ 无菌水

操作步骤：

① 倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days

② 用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG

液体培养基中，120rmp，28℃，12h

③ 以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h ④ 混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤

植物原生质体的融合技术探析 本文关键词：质体，探析，融合，植物，技术

植物原生质体的融合技术探析 本文简介：原生质体是组成细胞的一个形态结构单位,原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体,Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液,在一定条件下培养

植物原生质体的融合技术探析 本文内容：

　　原生质体是组成细胞的一个形态结构单位, 原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”, 是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体, Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液, 在一定条件下培养一段时间后, 发现大部分细胞的细胞壁被降解, 从而制备出大量有活力的原生质体。

　　1、原生质体融合的目的及意义

　　原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力, 使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合, 进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞, 克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍

水稻原生质体分离及转化

作者：植物逆境与光合实验室 | 发表日期：2014-04-11

实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验

实验材料和试剂：

生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。

溶液的配制： 母液的配制：

1、0.2 M MES(pH 5.7) 2、0.8 M Mannitol(甘露醇) 3、1 M CaCl2 4、2 M KCl 5、2 M MgCl2 6、10% BSA

[Fluka PEG 4000 81240]

以下如有上述母液，则都是使用的母液

酶解液：20 mL ×2 MES 0.5

mL

植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展

西北植物学报，0 72 ()00 -0 1 20,71;26 2 3Aca t Bo e l一)cd n . . t Bo . r a。〔ci e t S n i

文章编号：0 04 2 (0 70 -2 60 10-0 5 20 ) 100-8

植物体细胞杂交及其杂种鉴定方法研究进展张改娜，贾敬芬’(西北大学生物技术省级重点实验室，西安 706 ) 109

摘要：植物体细胞杂交使远缘杂交不亲和的植物有可能实现遗传物质重组，创造和培养植物新品种乃至新物种，尤其在多基因控制农艺性状的改良上具有较大优势。随着原生质体融合技术和现代分子生物学的发展，体细胞融合再生植株的植物种属范围不断扩大，杂种鉴定的方法和手段也有了很大提高。本文就近年来植物体细胞杂交的技术手段、筛选体系和杂种检测方法进行了综述，并展望了其应用和发展前景。关键词：体细胞；不对称杂交；杂种鉴定中图分类号： 93 1 Q 4.文献标识码： A

R sac P ors i Smai H bii t n eerh ges o t y r z i r n c d a o a d et i t n T e H bis Pa t n I nic i o hi y r

拟南芥原生质体制备转化操作流程

主要试剂

1. 纤维素酶解液： 试剂

15ml酶液体系

1． 1-1.5﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225g干粉

2． 0.2-0.4﹪ Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045g干粉 3． 0.4M mannitol 1.09g干粉 4． 20mM KCl 1 ml 0.3 M KCl母液

5． 20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6． 加入10ml 水

7． 55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂 8． 10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2

9． 5 mM β-Mercaptoethanol（可选用） 1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪ BSA， 1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）

11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。

2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品