表达载体的构建

关于表达载体的构建

1. 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类

载体既有复制子，更要有强启动子； 2. 大肠杆菌中的表达载体应含有 （1）强启动子

（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。

（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。

我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。

3. 载体构建的步骤 （1）.设计引物

1.引物的长度 用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

3. Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段

（4） P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

1 / 1文档可自由编辑

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位

一、目的基因的a(4.2k) PCR

1、PCR体系（引物ath-a-4.2k-F ath-a-4.2k-R 酶 fusion聚合酶 体积单位 μ l） DNA fusion 5*fusionHF 2.5mM F R ddH2O Buffer dNTP 2 *3 0.25 0.75 4 12 2 6 0.5 1.5 0.5 1.5 10.75 32.75 totle 20 60 98°C 30s 98°C 15s 56°C 30s 72°C 4min30s 72°C10min 16°C∝ 30cycle

（注：聚合酶说明：fusion聚合酶是高保真聚合酶，扩增片段为平末端） 2、跑胶

1％琼脂糖凝胶胶跑20min，观察实验结果。 3、胶回收（试剂盒回收） （1）、在紫外光下将扩增条带用刀切下，要尽量快（紫外会诱导基因突变）放在1.5mL的离心管中；（注意：刀头尽量伸进离心管内部，防止污染离心管外部可接触部位） （2）、在离心管中加入300-400μ l的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C水浴锅加热溶解直至透明； （3）、加0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。 （4）、吸取步骤3

第４０卷第７期

２００９年７月东北农业大学学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔ４０（７）：５５－５９Ｊｕｌｙ２００９Ａ—ｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

宋庆凤，暴立娟，李杰’

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨１５００３０）

摘要：巴斯德毕赤酵母（Ｐ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｒ／ｓ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达栽体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子一ＧＡＰ启动子替换毕赤酵母表达栽体ｐＰＩＣ９上的甲醇诱导型启动子ＡＯＸ，成功构建了毕赤酵母组成型表达栽体ｐＧＡＰＨａ。并以里氏木霉木聚糖酶基因ｘｙｎ２为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现ｘｙｎ２基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽ＩＮＵ替换栽体上原有的ａ—Ｆａｃｔｏｒ信号肽，结果表明，ＩＮＵ信号肽能够有效引导ＸＹＮＩＩ的分泌。

关键词：毕赤酵母；表达裁体；ＧＡＰ启动子；ＩＮＵ信号肽

中图分类号：文献标识码：Ａ文章编号：１００５—９３６９（２００９）０７－００５５－０５

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏ

百度文库-让每个人平等地提升自我

2运载体与基因表达载体的区别

1、不同点：

⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将目的基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。

相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目的基因这一功能，只要能运输目的基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目的基因。

⑵“基因表达载体”，是实施了运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。

这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同。

2、联系：

“基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的。

基因表达载体的构成：目的基因+ 启动子+ 终止子+ 标记基因。

3、表达载体上的启动子和终止子是本身具有还是后加上去的呢？

这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人的观点是：这要看获取目的基因的方法，而问题的根源在于基因的结构。关于基因的结构，在新课程标准中也不再做为教学的要求了。

（人类）结构基因的基本结构：上游非编码区+ 启动子+ 编码区+ 终止子+ 下游非编码区

人类结构基因4个区域：

①前导区，位于编码区上游，相当于RNA5’末端非编码区（非翻译区）；

②编码区，包括外显子与内含子；

③尾部区，位于RNA3’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；

④调控区，包括

脂联素

H nij n ln cn eeo g aA ig ic il am eS4

a d VeeayMei ie n it r rcn dn

N 2 0 9 o1 2 0

脂牛素基因联真核表达体载构建的及鉴定黄海龙 王，哲 于健国孙，,佳 (吉.大学林畜牧兽医学院，1吉长林春10;.63022林吉农业大学动科学技物术院，学吉林长春10 1 3)18 图分中号类 8: 32￥文献标识码： 文章编A号：40 04—2 02— )0—43 10 73 0(9 1 000

关键词：;牛脂联素基因；真核表达载摘体：要了构建脂联牛素基真核表达载体因，为试验采用 RT— P方法扩增R牛脂联素 o(iae iC b vd— n pcnB vnD 基N因 o,e t oA, P i)将其克隆到p 1 M D一8T体载中，正序的质确粒经 Eo I和 N测 ctR Io双酶 ,切回收目基的片因将段定其向克隆到pIZ tC o A载体P中，建重质粒组p Z￣I oA P结果表。构 P C Bo vDN A明：克隆基因的序与 G n列 ka Be n布的公序有 10列 0%同源性的；目的基因向正插入，阅读框正确无误 ,说牛明脂联素基因真核表达载体构建功成。C

载体构建 目的基因克隆引物设计PCR质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液PCR上述菌液PCR有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用）

取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）

依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）

反应所需试剂 体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液

载体构建 目的基因克隆引物设计PCR质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液PCR上述菌液PCR有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用）

取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）

依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）

反应所需试剂 体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体(SLC7a8)基因cDNA的读码框(CDS),构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠(wistar-kyoto,WKY)肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质

第 41卷第 6期 2 01 1年 1 1月

温

州

医

学

院

学

报

Vo1 . . No 6 41No 2 v. 011

J u na f W e z o e i a le e o r l o n h u M d c lCo l g

■大鼠 S C a基因的克隆及真核表达载体的构建 L T8王本极，黄晓燕，林素，周希，戴晓春，方俊旭，杨德业( . JJ 1温，医学院附属第一医院心内科，温州医学院心血管生物和基因研究所，浙江温Jl 3 5 0 i、 i 200、2温州医学院 .眼视光学院，浙江温州 3 5 0 ) 2 0 0

■

[摘

要]目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体 (L 78 SCa )基因eN

青岛农业大学 毕 业 论 文（设计）

题 目: 葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆

及其表达载体的构建

姓 名: 刘丽雪 学 院: 生命科学学院 专 业： 生物技术 班 级： 2007级4班 学 号： 20072833 指导教师： 薛仁镐

2010年6月17日

目 录

中文摘要···························································································································1 Abstract······························································································································2