pcr技术的原理和应用

PCR仪的原理及其操作应用 §1. PCR仪的技术原理 §2. PCR仪的分类与应用 §3. PCR仪的操作步骤轻纺与食品学院 报告人：裴乐乐 指导老师：林教授

§1.PCR原理简介PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚 合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外 扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过 程 ，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成。

PCR原理示意图

PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC)Target Sequence

Target Sequence

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；

PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

②模板DNA与引物的退火(复性):模

第八章 PCR技术及其应用

PCR技术的建立① Khorana(1971)等提出在体外经 DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—―修复复制”但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……

②

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现

Mullis的构思引物

DNA聚合酶

DNA聚合酶

引物

特定DNA片段

94℃变性

50-65℃退火

XX℃延伸

94℃

55℃

37℃

③

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术

Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)100

酶 80 活 性 6040

(%)

20 40 50 60 70 80 90 100

温度(℃)

94℃

55℃

72℃

PCR循环

Kary B. Mullis <>1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。“我不大喜欢动手,我宁肯不动手,

PCR仪的原理及其操作应用 §1. PCR仪的技术原理 §2. PCR仪的分类与应用 §3. PCR仪的操作步骤轻纺与食品学院 报告人：裴乐乐 指导老师：林教授

§1.PCR原理简介PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚 合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外 扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过 程 ，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成。

PCR原理示意图

PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC)Target Sequence

Target Sequence

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；

PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences

②模板DNA与引物的退火(复性):模

RT-PCR原理与实验技术

一、知识背景：

1、基因表达：DNA RNA Protein

单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白） 共合成109个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：

A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。

＋

3、逆转录酶和RT-PCR

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：

1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链

实时荧光定量PCR原理和实验 所属分类: 基因检测 更多见 www.infobio.org 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。

荧光定量PCR

荧光定量PCR技术 原理与结果 分析罗喜鹏

荧光定量PCR

一、含义 二、优越性 三、应用 四、定量方法 五、荧光材料 六、结果分析

荧光定量PCR

一、含义 实时荧光定量PCR技术(Real-Time

Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。

荧光定量PCR

二、优越性

特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与 传统的PCR相比，特异性大为提高。 敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml,对数期分 析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中 病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量 较为准确，标本不需稀释。 重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数 扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用， CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更 稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。 自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。

荧光定量PCR

三、应用 用于核酸的定量如RNA、DNA的定量 用于核

关于酶学

第27卷第6期

Vol127　No16长春师范学院学报(自然科学版)JournalofChangchunNormalUniversity(NaturalScience)2008年12月Dec.2008

应用于PCR技术的DNA聚合酶

盛艳敏,杨燕平,吴英杰,王倩倩

(长春师范学院生命科学学院,吉林长春　130032)

[摘　要]DNA聚合酶作为聚合酶链式反应(PCR)的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的

作用,在某种意义上甚至可以说,PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善

其酶学性能,已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研

究历史及现状进行简要综述。

[关键词]PCR;DNA聚合酶;酶学特性

[中图分类号]Q94615　　　[文献标识码]A　　　[文章编号]1008-178X(2008)06-0067-04

　　聚合酶链式反应(PCR)是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术,是在由DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液等组成的反应混合物中,由DNA聚合酶催化,对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片断进行扩增的反应。在此过程中,DNA聚合酶起着关键性作用,所以自PCR技术产生至今,人们一直在通

Module 8：

定量PCR新技术新应用

2基因组-DNA 水平Genomic

Sequence

Methylation

SNPs

CNVs

转录、调控-RNA 水平Protein 水平

3荧光定量PCR 应用?绝对定量?基因表达研究?转基因食品检测?相对定量?基因在不同样本中的表达差异?药物疗效考核?阴阳性分析?病原体（HBV ，HCV ，HIV 等等）检测?禽流感检测

?等位基因分型?SNP 分析

?与疾病相关的等位基因点突变检测拓展应用?MicroRNA 分析?基因拷贝数（CNV ）分析?表观遗传学（甲基化，乙酰化）分析?蛋白质分析?肿瘤稀有突变检测?其他

4AB 的TaqMan Assays 家族

?mRNA 分析试剂盒(基因表达)：TaqMan Gene Expression Assays(超过1,000,000个预设计试剂盒，覆盖21个物种)

?miRNA 分析试剂盒：TaqMan MicroRNA Assays

?SNP 分析试剂盒(基因分型)：TaqMan SNP Genotyping Assays(超过4,500,000个人类预设计分析试剂盒)

?DME(药物代谢酶) SNP 分析试剂盒：2600个SNP 位点，分布在220个药物代谢酶基因位点上的.

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得

《PCR技术及其应用》课程考试试卷

（硕士研究生）

班级： 硕士12班 学号： 20141100043 姓名 戴鹏辉 得分 ：

一、下页试题为单项选择题，请将每题的正确答案填在试卷首页的答题栏内（共50题，每题1.8分，总分90分） 题号 答案 题号 答案 题号 答案 题号 答案 题号 答案

1 11 21 31 41 2 12 22 32 42 3 13 23 33 43 4 14 24 34 44 5 15 25 35 45 6 16 26 36 46 7 17 27 37 47 8 18 28 38 48 9 19 29 39 49 10 20 30 40 50 二、简述RACE的原理和技术(10分)

1、PCR反应的五个要素是：（ ）

①引物 ②dNTP ③ Mg离子 ④ 模板 ⑤水 ⑥ TaqDNA聚合酶 ⑦水 请选择

A、①②③④⑤ B、①②③④⑥ C、②③④⑤⑥ D、①③⑤⑥⑦

2、PCR产物鉴定常用的方法是：（ ） A、凝胶电泳法 B、杂交法 C、免疫法

3、PCR反应中随着复性温