质粒与载体连接

质粒与载体

点击次数：442 发表于：2008-07-08 17:32　转载请注明来自丁香园
来源：互联网


一、质粒

绝大多数的生物都是以DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication，或译为复制起点)，使整个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为replicon，我们姑且把它译为为复制体吧！原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。它们的基因体约由2,000至150,000个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如Borrelia burgdorfferi)。事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。在自然环境中它们相当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌(Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌(Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。以下我们谈的以细菌性质粒为主，

基因克隆的质粒载体

在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

第一节 质粒的一般生物学特性

一、质粒DNA

细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。

1

质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：

1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），

目的基因与载体连接、 感受态制备及转化

【实验原理】

1；酶促生物化学反应过程

在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。 2；DNA连接酶的分类：

T4 DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接

大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子

3；T4 DNA连接酶：来源 T4噬菌体感染的大肠杆菌

最佳pH值 7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液 需ATP，Mg2+参加反应

二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接 作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。

4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细

胞两类。

5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统 真核细胞：主要用于外源基因的表达

6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。

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2运载体与基因表达载体的区别

1、不同点：

⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将目的基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。

相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目的基因这一功能，只要能运输目的基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目的基因。

⑵“基因表达载体”，是实施了运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。

这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同。

2、联系：

“基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的。

基因表达载体的构成：目的基因+ 启动子+ 终止子+ 标记基因。

3、表达载体上的启动子和终止子是本身具有还是后加上去的呢？

这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人的观点是：这要看获取目的基因的方法，而问题的根源在于基因的结构。关于基因的结构，在新课程标准中也不再做为教学的要求了。

（人类）结构基因的基本结构：上游非编码区+ 启动子+ 编码区+ 终止子+ 下游非编码区

人类结构基因4个区域：

①前导区，位于编码区上游，相当于RNA5’末端非编码区（非翻译区）；

②编码区，包括外显子与内含子；

③尾部区，位于RNA3’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；

④调控区，包括

目的基因与载体连接、 感受态制备及转化

【实验原理】

1；酶促生物化学反应过程

在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。 2；DNA连接酶的分类：

T4 DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接

大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子

3；T4 DNA连接酶：来源 T4噬菌体感染的大肠杆菌

最佳pH值 7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液 需ATP，Mg2+参加反应

二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接 作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。

4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细

胞两类。

5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统 真核细胞：主要用于外源基因的表达

6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。

质粒图谱列表(转贴) (2007-11-19 20:32:55)转载▼ 分类： 核酸技术

登记号--质粒--来源--用途--图谱提供者 0001--pIRES --BD Co--真核表达--yshu3507 0002--pECFP-C1--BD Co--真核表达--yshu3507 0003--pShuttle--/--/--victoh 0004--pSBR322--/--/--chujun_hust

0005--pcDNA3.1(+)/CAT--invitrogen--真核表达--wangjun2002274 0006--pQEx--Qiagen--原核表达--wangjun2002274 0007--pIVEX2.3--Roche--体外转录翻译--wangjun2002274 0008--pIRES-EGFP--/--/--luoqingli2003

0009--pET-28a（+）--Novagen--原核表达--wangjun2002274 0010--pSUPER Vector--oligoengine--siRNA--zyh961171 0011--pET-32a(+)--novagen--原核表达--Crazyvirus

山东大学实验报告

姓名 宿智新 学院 生命科学学院 班级 11级生工2班 科目 分子生物学实验 学号 201100140155 第 8 组

质粒DNA的提取、纯化与鉴定

摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5?（E.coli DH5?）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。 关键词：碱变法 质粒 电泳 实验目的：

1. 学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2. 学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3. 学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4. 掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5. 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 实验原理：

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度

基因序列分析：

同源比对（保守性） 不同蛋白比对相似序列 预测结构域 记录：

1） 保存预测结果（同源性、二级结构）

2） 记下mapping片段（mapping时以亲水端开头，考虑溶解性），相关性质（分子量、等

电点、碱性残基数（R250）、W+Y数目、摩尔吸光系数）

3） 确定载体（原核：His-tag/Trx-tag/MBP-tag；真核：GFP-tag/Cherry-tag/Flag-tag）

网站：

NCBI CDS（mRNA编码区) Expasy 软件： Jalview

1） sequence alignment：

a、用目的基因序列进行BLAST（NCBI），比较不同物种间（哺乳、两栖、低等……）该基因的保守性（xp,np来源较可靠）。（或直接基因名+物种名进行搜索）； Main:

human/Homo sapiens

chimpanzee/Pan troglodytes monkey/Macaca mulatta dog/

horse/Equus caballus cattle/Bos taurus pig/ Sus scrofa

mouse/Mus musculus Rat/Rattus norvegi

齐 齐 哈 尔 大 学

毕业设计（论文）

题 目 靶向MRP1基因pRNAT-H1.1/shuttle-RFP重组质

粒表达载体构建

学 院

专业班级

学生姓名

指导教师

成 绩

2011 年 6 月 20 日

齐齐哈尔大学毕业设计(论文)

摘 要

癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（Multidrug Resistance-associated Protein 1，MRP1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。RNA干扰(RNA in

1 分子实验报告 2013030020华天瑞

Preparation of Plasmid DNA, Restriction Enzyme Digestion, and

Agarose Gel Electrophoresis

2014/10/14-21

1 Intro

1.1 Objective

To learn

? The characteristics of plasmid DNA

? The method of plasmid DNA mini-preparation by alkaline lysis and the measurement of

DNA concentration by spectrophotometer ? The characteristics of restriction endonuclease

? How to use agarose gel electrophoresis to separate DNAs To understand: The principles of pu