酵母蛋白表达系统

酿酒酵母表达系统-半乳糖诱导外源蛋白表达实验

培养基：

SC尿嘧啶缺陷培养基（2%GLucose） SC诱导培养基（2%半乳糖）

贮存液：

20%葡萄糖（W/V） 20%半乳糖（W/V） 贮存液过滤除菌，4℃保存。

SC培养基高温高压灭菌，待培养基温度降低至60℃以下后，加入相应体积的葡萄糖或者半乳糖，混匀，4℃保存备用。

实验流程：

1.将转化pYES2的INVSC单克隆接种到15ml SC（2%葡萄糖）选择培养基中。 2. 30℃震荡过夜培养。

3.测定过夜培养菌液的OD600，计算配制50ml OD600=0.4的菌液所需的过夜培养的菌液体积V。

eg：例如过夜培养菌液OD600=3，则V=（0.4OD/ml）（50ml）/（3OD/ml)=6.67ml。 4.取V体积过夜培养的菌液于50ml离心管中，4℃，1500g，离心5min，收集菌体。

5.用1-2ml SC诱导培养基（SC+2%半乳糖）充分重悬菌体，将诱导培养基补充至50ml，，将菌液全部转移至无菌250ml三角瓶中，30℃震荡培养。 6.分别于接种诱导培养基2,4,6,8h后，取5ml菌液测定OD600。 7.4℃，1500g，离心5min，收集菌体。 8.去上清，用

毕赤酵母表达系统步骤

（参考Invitrogen公司说明书）：

一、 pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存

1 取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2 挑取转化子，甘油保存。 二、 载体构建

1 将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。

2 提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3 载体测序

测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物 三、 线性化DNA

1 提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）； 四、线性化DNA的去磷酸化处理 线性化质粒 43μl CIAP Buffer 5μl

CIAP酶 2μl

四、 总体积为50μl的样品37℃ 1h

巴斯德毕赤酵母及启动子

1.1 毕赤酵母表达系统简介

随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。

随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。

毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。

翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。

菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,

高效蛋白质表达系统1. 原核表达系统 (1)Gram negative (E. coli) (2)Gram positive (B. subtilis) 2. 真核表达系统 (1) Yeast (2) Baculovirus (3) Drosophila (4) Mammalian cells (COS, CHO, BHK etc.) 3. 其它 (1) Cell-free system (2) Protoblast

Protein Expression

Protein expression is a subcomponent of gene expression. It consists of the stages after DNA has been translated into amino acid chains, which are ultimately folded into proteins. In its simplest form, a protein expression system involves a template, a mechanism of transcription/translation such as

http://www.abbkine.com

常见蛋白表达系统的比较

在生物学研究中，重组蛋白的研究越来越受到关注，而重组蛋白最为重要的莫过于表达系统的选择。蛋白表达系统是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。常见的蛋白表达系统分为原核表达系统和真核表达系统，具体又可以细分多种，每一种有各自的优缺点。在此，小编给大家整理了各表达系统间的差异，供大家参考。

表达系统 原核生物 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 代表工程菌株 BL21-PET系统 特点 具有原核细胞良好的可操作性，成本低，产率高，但不能进行糖基化修饰，胞内分泌形成包涵体，且易产生内毒素。 产量 外源蛋白占细菌总蛋白量：胞内表达10%-70%，胞外表达0.3%-4%。 B．subtilis系细胞壁不含内毒素，很强统、B. brevis系的胞外分泌蛋白能力，蛋统 白酶易对目的蛋白降解，重组表达质粒不稳定，真核蛋白分泌量低。 酿酒酵母 兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力，但存在产量低及过度糖基化等问题。 外源蛋白占菌体总蛋白量： 10%-30%。 酵母 外源蛋白占菌体总蛋白量：约10%。 甲醇营养型 酵

酵母双杂交系统

酵母表达系统的研究进展和前景

( XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院 )

摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。

关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物

引言

酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。酿酒酵母（Saccharomyces. cerevisiae） 在分子遗传学方面被人们的认识最早， 也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表

1．培养基的配制

原理

http://wenku.http://www.wodefanwen.com//link?url=B2SX0TUS5KB2ovXQcKyds9MS9OnW7y5Yn204CH3vg44FsTWICJAnwePCb013a9T-vzmX5g9oCbv6GSuPahN6jfA9hVhQXCd3QCMZ_NTscu7

步骤

LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。

LB培养基的配制：

成分

胰蛋白胨(tryptone) 10g

酵母提取物(yeast extract) 5g

氯化钠(NaCl) 10g

固体培养基另加 琼脂粉 15-20g

加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min

配制方法

（1）称量 分别称取所

1．培养基的配制

原理

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步骤

LB培养基，是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，其分为液态或是加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。尽管该培养基的名称被广泛解释为Luria-Bertani 培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法，这个名字来源于英语的 lysogeny broth，即溶菌肉汤。

LB培养基的配制：

成分

胰蛋白胨(tryptone) 10g

酵母提取物(yeast extract) 5g

氯化钠(NaCl) 10g

固体培养基另加 琼脂粉 15-20g

加双蒸水至1000mL, 用5mol/L NaOH（约0.2ml）调pH至7.2，121℃灭菌30min

配制方法

（1）称量 分别称取所

很好，需要好好研究一下

原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非 a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案： 1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶； 2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了； 3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。 在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题） 1、制感受态细胞，OD多少比较好？ pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低

2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use