超氧化物歧化酶活性的测定实验目的

植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法

【实验目的】

1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。 2. 熟悉植物叶片中ROS去除机制。 【实验原理】

超氧化物歧化酶（SOD）普遍存在于动植物与微生物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧阴离子自由基 （O2—），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。

超氧阴离子自由基（O2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。生成的H2O2可被过氧化氢酶分解为O2和H2O：

2 O2—+ 2H+ H2O2+O2 2 H2O2 CAT O2+H2O

SOD

超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD活性。本实验依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2—。当加入NBT后，在光照条件下O2—又可将NBT还原为蓝色的甲腙，后者在5

超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术

证明SOD提取过程工艺不同浓度的硫酸铵对纯化SOD蛋白酶的效果

的综合影响

一、摘要：

通过对绿豆的研磨破碎获得SOD粗酶，经过(NH4)2SO4分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶中的杂质及干扰蛋白。

二、关键词：

SOD 连苯三酚自氧化法 SOD酶活性测量 透析除盐

三、前言：

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶.它是一种源于生命体的活性物质，SOD是机体内危害最大的氧自由基专一清除剂，亦是其他自由基最有效的清除剂，它与体内的谷胱甘肽过氧酶、过氧化氢酶联手，把自由基转化为水和氧分子。能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

四、实验技术路线：

我们的这次试验主要的路线是通过测定经过不同浓度的硫酸铵分离出来的不同的SOD蛋白的上清和沉淀，以此来确定硫酸铵沉淀SOD酶和其他杂蛋白的一个大致区间

SOD

超氧化物歧化酶（ 超氧化物歧化酶（SOD） ）

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全球瞩目的生物奇葩 现代生命科学的新宠

超氧化物歧化酶（SOD） 超氧化物歧化酶（SOD）

英文Superoxide Dismutase的缩写，其化学性 英文 的缩写， 的缩写 质为蛋白质（金属类）源自生命体的活性物质， 质为蛋白质（金属类）源自生命体的活性物质，是体 内对抗自由基的第一道防线。是由含109个和 个和119个 内对抗自由基的第一道防线。是由含 个和 个 氨基酸的两个肽链组成。 氨基酸的两个肽链组成。主要作用是清除氧自由基和 体内垃圾。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢， 体内垃圾。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢，就会 产生超氧阴离子自由基，若不予以消除， 产生超氧阴离子自由基，若不予以消除，会在体内产 生连锁反应，破坏我们的细胞， 生连锁反应，破坏我们的细胞，是人体老化及疾病的 元凶。 元凶。

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SOD-不老物质 震惊世界的发现！ 不老物质—震惊世界的发现 不老物质 震惊世界的发现！

30年代keilie（凯林） 和Mann（盖尔曼） 剑桥大学 1998年 罗伯、费瑞和洛伊格纳洛 诺贝尔生理医学奖 1969年Mc

大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶的分离纯化

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F o n emett n Id sr s o da dF r nai n ut e o i

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大蒜细胞溶质中超氧化物歧化酶的分离纯化艘蠲

谢岩黎，

李元瑞

l西北农林科技大学食品科学与工程学院，凌， 1 1 0 (杨 720 ) 2河南职业技术师范学院食品科学与工程系，乡，5 0 3 (新 4 30 )

摘

要

采用热变性、乙二醇 ( E 60聚 P G)0 0沉淀作用和 D AE纤维素柱层析 3种方法对大 E一

蒜细胞溶质中的超氧化物歧化酶进行分离纯化。经过 3步分离纯化， 5 0大蒜中得到从 0g 1 . mg产品，活为 31 5 5 rg酶的类型是 C nS 56比 4 . a。 U/ u Z -OD,紫外区的最大吸收峰是 2 8在 5nm o

关键词

大蒜细胞溶质，超氧化物歧化酶，分离纯化

超氧化物歧化酶 (u eo ieds ts, sp rxd i muae S oD)一种具有清除体内超氧自由基 ( -是 02

1 3试验设备 .

uv一 1 0紫外一见分光光度计、速冷 10可高冻离心机 ( u o tRC 5 )恒温水浴锅、 D P n 一C、核酸蛋

土壤酶的测定

1． 三角瓶用稀HNO3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。 2． 土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g ，重复一次，14.5×2=29g。

一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）

1．试剂配制：

(1)0.3%过氧化氢溶液：

①（1：100 30%的H2O2和水） ②（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水） ③（1ml30% H2O2+99ml蒸馏水） (2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水） (3)0.1N高锰酸钾溶液 ：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）

2．操作步骤：

2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色

3．结果计算

过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO4的毫升数表示： M=（A－B）×T 式中：

A：空白消耗的0.1N KMnO4 毫升数

B：滤液消耗的0.1 N KMnO4 毫升数 T：KMnO4

叶绿体的提取

一、试剂配置

1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO（0.0005=0.1g）；4200×使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）; 2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）； 3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；

实际配制：

PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),

悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;

80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）

二、提取步骤

1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10

准确称取天山云杉种子0.1 g，先加入 1 ml 预冷的50 mmol/ L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，内含1 mmol/ L EDTA)，研磨成匀浆，然后用 4.5 ml 分两次冲洗研钵至试管中，4 ℃，10000 r/min 离心 20 min，上清液即为酶提取液，4 ℃保存用于ROS系统酶活性分析。 3 酶活性的测定

3.1 过氧化物酶 (POD，EC 1.11.1.7) 活性的测定。

按照 Chance 和 Maehly[6]的方法，并作如下修改:反应混合液为50 mmol/ L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，内含 0.1 mmol/ L EDTA) 2.9 mL，2 % H2O2 1.0 mL，50 mmol/ L 愈创木酚1.0 mL。测定时，反应混合液先在 25 ℃ 水浴中预热，立即加入0.1 mL酶液以启动反应，以缓冲液调零，测定OD470值，每隔 30 s读数一次。取 0 — 60 s 时间段，即 1 min 反应时间来计算酶活性。以每分钟OD470增加0.01的酶量为一个酶活单位，U·g-1。

计算公式: POD活性 = ΔA470 × Vt × (0.01× t × FW × V1) -1 注: ΔA470:反应时间内

过氧化物酶活性的测定POD

一、原理：

过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。，

二、实验准备

仪器：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器 试剂：

愈创木酚、30%H2O2、0.2mol/L磷酸缓冲液（7.8）、0.1mol/L磷酸缓冲溶液（PH6.0，见附录） 反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲溶液（PH6.0）50ml，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）30%H2O2 19μl，混合均匀，保存于冰箱中。]

三、步骤：

1、粗酶液的提取：称取植物材料0.4-0.5g，加磷酸缓冲液（7.8）5ml（分几次加入），于研钵中研磨成匀浆，以8000r/min离心10min，收集上清液于冷处（冰箱4度保存）。

2、酶活性的测定：一个试管入反应混合液3ml，磷酸缓冲液（7.8） 1ml，

.

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法

一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托

（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；

（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配

植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法

【原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 【仪器与用具】

紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平 【试剂】

1. 0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液

2. 0.2mol/L H2O2溶液：30% H2O2 11.36ml溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。 3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液（pH7.0） 【材料】

正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织 【方法步骤】

1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4℃下保存备用。

2.CAT活性测定

（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。 （2）取10ml具塞试管，3