生物学常用的实验方法

常用分子克隆实验方法I

一、植物总DNA的小量提取

方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。

(1) 充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液

A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min；

(2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的

溶液B，静置3min;

(4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，

再用移液枪吸走大部分残余液体；

(5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍

吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min；

(6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm

离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。

方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸

生物信息学常用网站及其使用说明

分子生物信息数据库简介

生物信息学常用网站及其使用说明

数据库类型随着近年来生物学实验方法和检测手段的不断发展与提高，积累了大量生物学的实验数据，通过对这些数据按一定目标与功能分类收集整理，形成了目前数以百计的生物信息数据库。

核酸和蛋白一级数据库、基因组数据库生物大分子三维空间结构数据库以上一级数据库为基础而形成的二级数据库

生物信息学广西医学科学实验中心

xy

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分子生物信息数据库概述1960年代，第一个分子生物学数据库——Fred Sanger的胰岛素序列测定(1955)——蛋白质数据库PSD(Protein Sequence Database)——Margaret Dayhoff: 1960年代，创立PSD,即PIR的前身 1978,scoring matrices——PAM

Fred Sanger at The Wellcome Trust xy生物信息学广西医学科学实验中心 Sanger Institute

Pioneer in Bioinformatics Dr. Margaret O. Dayhoff (1925-1983)3

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1982年，第一个核酸

总RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1. 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放臵5分钟； 3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放臵2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4. 取上层水相臵于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放臵10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟； 5. 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离

（一）Western-blot实验 1. Western blot主要实验试剂

溴酚蓝（Bromphenol Blue） 丽春红（Ponceau S） 考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue R-250）

吐温-20（Tween-20） β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol) 十二烷基硫酸钠（SDS ） 过硫酸铵（APS） TEMED 聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液 4×浓缩胶缓冲液

生物学常用试剂配制 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】

常用试剂

储存注意事项：储存于阴凉、通风的地方；远离火种、热源。避免光照。室温不超过30℃，相对湿度不超过80％。包装必须密封，切勿受潮。应与易（可）燃物、还原剂、碱类、醇类、食用化学品分开存放，切忌混储，储区应备有合适的材料收容泄漏物。

操作注意事项：尽量在通风橱操作，加强通风，避免粉尘扩散。远离易燃、可燃物，避免与还原剂、碱类、醇类接触，防止包装及容器损坏。

EDTA（PH ）

组分浓度: mol/L EDTA（MW：）

配制量: 500ml

配制方法:

1．称取93g Na2EDTA·2H2O置于500ml蓝盖瓶中。

2．加入400ml的去离子水，置于磁力搅拌器上充分搅拌。

3．用NaOH调节调节pH值至（约需加入20g固体NaOH），当pH 接近时，EDTA方可完全溶解，加入去离子水定容至1L。

4．高温高压灭菌后，室温保存半年。

5M NaCl

组份浓度： 5mol/L NaCl (MW：

配制量： 1L

配制方法：

1.准确称取氯化钠，置于1L的蓝盖瓶中。

2.用去离子水溶解并稀释

一.常用贮液与溶液

1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小

份贮存于-20℃。

10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无

DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。

1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存

于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。

8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到

100ml。

1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.

生物学大实验（硕士研究生实验课内容）

一． 细胞培养技术与方法 1. 教学目的与要求：

1) 了解细胞培养室的设置，设备和无菌操作。 2) 掌握细胞培养用器械的清洗与消毒方法。 3) 掌握细胞培养的实验程序 。

4) 掌握细胞的复苏、细胞的计数、细胞的传代培养、细胞的冻存方法。

2. 教学内容：

（1）实验器材的清洗包装和消毒：

一）玻璃器械洗消：

（一）新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200mL：蒸馏水1000mL）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次，用双蒸水过3次。

5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。 6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。 7.高压消毒后烘干 。

（二）旧的玻璃器皿的洗消：

1.刷洗、烘干：使用

生物学大实验（硕士研究生实验课内容）

一． 细胞培养技术与方法 1. 教学目的与要求：

1) 了解细胞培养室的设置，设备和无菌操作。 2) 掌握细胞培养用器械的清洗与消毒方法。 3) 掌握细胞培养的实验程序 。

4) 掌握细胞的复苏、细胞的计数、细胞的传代培养、细胞的冻存方法。

2. 教学内容：

（1）实验器材的清洗包装和消毒：

一）玻璃器械洗消：

（一）新的玻璃器皿的洗消： 1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200mL：蒸馏水1000mL）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次，用双蒸水过3次。

5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。 6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。 7.高压消毒后烘干 。

（二）旧的玻璃器皿的洗消：

1.刷洗、烘干：使用

普通生物学实验（三）

教 案

目 录

35、细菌的简单染色、革蓝氏染色???????????????????????3 36、细菌的芽孢、荚膜、鞭毛染色鉴定及运动性观察???????????????5 37、微生物细胞形态及菌落特征观察??????????????????????11 38、培养基制作、灭菌与无菌操作接种技术??????????????????? 19 39、微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数???????????????????35 附：微生物的菌种保藏?????????????????????????????41 40、微生物鉴定中常用的生化反应……………………………………………………………45 附：微生物自动鉴定仪鉴定???????????????????????????48 41、微生物细胞大小测定及显微镜直接计数 ??????????????????51 42、乳酸菌分离及食用乳酸制作 ???????????????????????55 ①乳酸菌分离与鉴定?????????????????????????????55 ②食用乳酸制作???????????????????????????????55

普通生物学实验（三）

教 案

目 录

35、细菌的简单染色、革蓝氏染色???????????????????????3 36、细菌的芽孢、荚膜、鞭毛染色鉴定及运动性观察???????????????5 37、微生物细胞形态及菌落特征观察??????????????????????11 38、培养基制作、灭菌与无菌操作接种技术??????????????????? 19 39、微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数???????????????????35 附：微生物的菌种保藏?????????????????????????????41 40、微生物鉴定中常用的生化反应……………………………………………………………45 附：微生物自动鉴定仪鉴定???????????????????????????48 41、微生物细胞大小测定及显微镜直接计数 ??????????????????51 42、乳酸菌分离及食用乳酸制作 ???????????????????????55 ①乳酸菌分离与鉴定?????????????????????????????55 ②食用乳酸制作???????????????????????????????55