质粒快速转化法

重组质粒的转化

重组质粒的转化(热休克法)

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 本流程以α-互补鉴定为例。适用于含有?-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。

㈠试剂及材料:

1. IPTG溶液(异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。 2. X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。 3. LB液体培养基（无抗生素）。

4. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4μl 200mg/ml IPTG和16μl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核

酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA

分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。

5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大

小。

7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

摘要

本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hind Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hind Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。

关键字 酶切 连接 转化 重组子琼脂糖凝胶电泳

引言

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coliDH5α,载体是PUC19。

DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类

产品简介

本试剂盒对传统的碱裂解法进行了优化，可以在8 min内获得高质量质粒DNA。优化的裂解液可以使得离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，高效、专一吸附DNA。以下操作步骤适用于提取1-4 ml过夜培养的大肠杆菌，质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒拷贝数，质粒的稳定性，抗生素等因素有关。

使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

提取得率

质粒类型 菌液量 得率 质粒

pBR322, pACYC及其衍生载体

低拷贝 1-4 ml 3-10 μg pSC101及其衍生载体，

SuperCos, pWE15 高拷贝

1-4 ml

6-24 μg

pTZ, pUC, pBS, pGM-T

注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。

1． 溶液P1在使用前先加入RNase A和TIANRed（将试剂盒中提供的RNase A和TIANRed全

部加入），混匀，置于2-8℃保存。

2． 使用前请先检查溶液P2和P5是否出现浑浊，如有混浊现象，可在

大肠杆菌的培养

1. LB培养基配制： （液体培养基） ① 取1L的烧杯，加入适量的一蒸水（＜1000ml），称取胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5g , Nacl 10 g 倒入烧杯中

② 加入磁子搅拌，至完全溶解 ③ 用NaoH调PH=7.0，定容至1L ④ 分装后高压蒸汽灭菌 （固体培养基） ① 在液体培养基的基础上加入琼脂糖：1L液体培养基→15g琼脂糖（用水先溶解） ② 在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解 ③ 分装后高压灭菌

抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 注意事项：

① 电炉子温度不要太高，烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网 高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出 2. 倒平板：

培养皿要提前进行灭菌、烘干，在超净工作台里，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操作，倒完后做好标记

3. 接种（平板划线分离法）：

接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：

注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。 4. 37°恒温培养箱培养：

接种好的培养皿正置15分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养

倒置培养原因：恒温

上火牙疼快速止疼法

有一句话说的好：“牙疼不是病，疼起来要人命。”这句话可谓是深深地道出了牙疼人的心声。由于引起牙疼的起因有很多种，这里我们就着重解决上火引起的牙疼，如何对上火引起的牙疼进行快速的止疼。

1. 帕芙欧牙疼喷雾：如果你经常会因为上火而牙疼，不妨给自己备一份帕芙欧牙疼喷雾。帕芙欧牙疼喷雾运用现代方法将多种中草药精华浓缩提炼成的强效配方。只要你轻轻地喷上一喷就能快速止疼，是现在治疗牙疼最快速的方法。出门工作解决牙疼，推荐你随身携带帕芙欧牙疼喷雾。

2.漱口：要是在家实在是牙疼的厉害，你不妨到厨房自己配比盐水进行解决。我们知道医疗上的0.9%氯化钠有消毒杀菌的作用，自己配不出来也没关系。你可以取一勺的盐，兑上半杯的开水，搅拌融化后，用自己配比的盐水进行多次的漱口，这样也能解决痛彻心扉的牙疼。

3.掐合谷穴：这个穴位是通过中医师了解到能快速缓解牙疼的方法。合谷穴在哪里呢？合谷穴就是在拇指骨和食指骨的交界处。如果牙疼了，只要猛掐合谷穴，你就能够感受到牙疼有所缓解。据了解，掐合谷穴可以缓解50%的疼痛。

4.黄连上清片：大多数人都会有这样的念头就是上火了就吃黄连上清片。上火牙疼出现了的时候，你可能也在服用黄连上清片，但是牙疼还会不断地出现，我们不妨换

质粒图谱列表(转贴) (2007-11-19 20:32:55)转载▼ 分类： 核酸技术

登记号--质粒--来源--用途--图谱提供者 0001--pIRES --BD Co--真核表达--yshu3507 0002--pECFP-C1--BD Co--真核表达--yshu3507 0003--pShuttle--/--/--victoh 0004--pSBR322--/--/--chujun_hust

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0009--pET-28a（+）--Novagen--原核表达--wangjun2002274 0010--pSUPER Vector--oligoengine--siRNA--zyh961171 0011--pET-32a(+)--novagen--原核表达--Crazyvirus

风囸教育1对1个性化教案

学 生 教 师 课 题 重 点 难 点 1、转化法解分数应用题 学 校 授课日期 年 级 授课时段 年级 转化法解分数应用题 有些稍复杂的分数应用题中经常有好几个单位“1”量，要正确地解答这些题目，必须先分清楚各个不同单位“1”量，然后再把题中的某一种量看作单位“1”，把其他所有的分率都转换为这个单位“1”的几分之几，再按照简单应用题的方法来计算。

二、典型例题

例1．果园里有苹果树和梨树共420棵，苹果树棵数的

例2．兄弟四人合买一台彩电，老大出的钱是其他三人出钱总数的老三出的钱是另外三人出钱总数的

例3．甲、乙、丙三人各有人民币若干元，丙的钱数比甲少的钱数多200元，求甲、乙、丙三人各有人民币多少元？

14等于梨树的，问这两种果树各有多少棵？ 3911，老二出的钱是另外三人出钱总数的，231，老四比老三多出40元。求这台彩电多少钱？ 411，丙的钱数又比乙多，已知甲的钱数比乙102三、熟能生巧

1．甲、乙二人共有存款1800元，甲取出他的原来各有存款多少元？

2．一位老人去世后留下一笔遗产分给其三个子女。老大分的财产是其余两人的

12，乙取出他的以后，二人

六爻快速推断法 第一章：起卦 第一节：起装

起 装

起装即是起卦，起卦可以说是一门艺术。起装的不好，就会影响六爻快速准确的推断。 起装的一切程序，也就是

1：记下预测时的年月日时，这时最好先定好用神。例如凡测可先取世爻为用神人。 2：起好排好卦爻。本变卦爻最好都要排出。

用来排卦爻的纸，一般研究者使用白色纸。白纸黑字，一目了然。对外预测一般使用 红色纸，因为红色在中国民俗中代表吉利喜庆。它醒目明亮，可以刺激人们的视觉神经系 统引起兴奋，形成热烈欢快的气氛，并且容易使求测者注目和专心，同时也容易于招来生 意。但现代很多研究者使用白纸，这不仅具有现代意义，同时有的研究者也认识到红色接 触太多则会使人焦燥不安，进行大量推断后很容易产生疲劳，这一点也应略加以注意。 排写卦爻又称为布卦。布卦犹如用兵打战，先要摆好阵势，才可迎敌作战。－－－阵 势摆的越好，就越有利于行军做战。

布卦的要旨是：1、要写的正确。2、写的方式要构成对自已有利、对思维和快速推断 有利。写的方式也略有讲究，一般来说写的方式要构成对自已推断的思维、速度和准确有 利的卦势，使远近可以声援，先后可以呼应。完全可以说布

基因序列分析：

同源比对（保守性） 不同蛋白比对相似序列 预测结构域 记录：

1） 保存预测结果（同源性、二级结构）

2） 记下mapping片段（mapping时以亲水端开头，考虑溶解性），相关性质（分子量、等

电点、碱性残基数（R250）、W+Y数目、摩尔吸光系数）

3） 确定载体（原核：His-tag/Trx-tag/MBP-tag；真核：GFP-tag/Cherry-tag/Flag-tag）

网站：

NCBI CDS（mRNA编码区) Expasy 软件： Jalview

1） sequence alignment：

a、用目的基因序列进行BLAST（NCBI），比较不同物种间（哺乳、两栖、低等……）该基因的保守性（xp,np来源较可靠）。（或直接基因名+物种名进行搜索）； Main:

human/Homo sapiens

chimpanzee/Pan troglodytes monkey/Macaca mulatta dog/

horse/Equus caballus cattle/Bos taurus pig/ Sus scrofa

mouse/Mus musculus Rat/Rattus norvegi